葛向平 趙姍姍

（山東省膠州市畜牧獸醫(yī)局，山東省膠州市 266300）

副豬嗜血桿菌病的診斷實(shí)例

葛向平 趙姍姍

（山東省膠州市畜牧獸醫(yī)局，山東省膠州市 266300）

對(duì)山東省某豬場(chǎng)疑似患副豬嗜血桿菌病的豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷的結(jié)果表明，分離到的病原菌為革蘭氏陰性桿菌，經(jīng)PCR鑒定，其擴(kuò)增片段與目的片段大小相符，進(jìn)而確診為副豬嗜血桿菌病。

副豬嗜血桿菌??；實(shí)驗(yàn)室診斷；PCR

副豬嗜血桿菌 （Haemophlius parasuis，HPS）又稱(chēng)豬革拉斯氏病 （Glasser's disease）[1]，主要臨床癥狀為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂。按Kieletein-Rapp-Gabriedson（KRG）瓊脂擴(kuò)散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為l5個(gè)血清型，另有20%以上的分離株血清型不確定。我國(guó)主要以血清型4、5和l3最為流行[2]。在基層養(yǎng)殖中，確診該病有利于及時(shí)采取正確的防治措施控制疾病，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

山東某豬場(chǎng)送檢的疑似副豬嗜血桿菌病病料 （心血、肺、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等）。

1.2 材料與試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000等 （大連寶生物工程有限公司）；胰蛋白胨大豆瓊脂 （TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯 （TSB）培養(yǎng)基 （美國(guó)BD公司）。

1.3 主要儀器

PTC-2000型PCR儀 （美國(guó)MJResearch公司）；凝膠成像系統(tǒng) （Alpha Innotech公司）；2A200型電泳儀 （Amersham公司）。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Simone Oliveira等[3]報(bào)道，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為822 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 菌種分離與純化

無(wú)菌采集病豬的心包積液、胸腔積液、關(guān)節(jié)液和心血，劃線接種于含0.01%NAD和5%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48小時(shí)，挑取優(yōu)勢(shì)菌落染色鏡檢。

1.6 PCR鑒定

1.6.1 細(xì)菌DNA模板的制備

將疑似菌落接種于含0.001%NAD和5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中，置于37℃、180轉(zhuǎn)/分搖床上培養(yǎng)24小時(shí)；取被檢菌株菌液以10 000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液，用無(wú)菌水懸浮沉淀，渦旋后于沸水中煮沸10分鐘，-20℃凍結(jié)；待融化后，10 000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清液作模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[4]。

1.6.2 組織DNA模板的制備

向心臟、肺臟等組織中加入適量PBS溶液進(jìn)行研磨，5 000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清液、心包液、關(guān)節(jié)液一同進(jìn)行組織DNA提取。500μL心包液、關(guān)節(jié)液和組織上清液中加入50μL 10%的SDS溶液和10μL 50μg/mL的蛋白酶K，56℃水浴2小時(shí)；加入200μLTris飽和酚，充分混勻后12 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘；取上清于一個(gè)新離心管中，加入Tris飽和酚和氯仿各200μL，充分混勻后12 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘；取上清于一個(gè)新離心管中，加入200μL氯仿，充分混勻后12 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘；取上清于一個(gè)新離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃靜置20分鐘，12 000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清；加入70%乙醇沖洗沉淀表面及管壁，棄乙醇，晾干后加入20μL滅菌水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

25μL體系：細(xì)菌DNA模板或組織DNA模板3μL、10倍 PCR緩沖液2.5μL、dNTP（10 mmol/L）0.5μL、引物各1μL（25mmol/L）、TaqDNA聚合酶0.3μL。陰性對(duì)照不加模板，以等量滅菌水代替。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5分鐘、94℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分鐘，34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察是否有目的條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)

將純化好的細(xì)菌接種于含5%牛血清和0.001%NAD的TSA培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)后，挑取優(yōu)勢(shì)菌落染色鏡檢，觀察到呈革蘭氏陰性小球桿菌，老齡培養(yǎng)物呈多形態(tài) （細(xì)小桿狀、短鏈狀和長(zhǎng)絲狀） （圖1）。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

用HPS特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從菌液和病豬組織中均擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)度為822 bp的DNA片段 （圖2）。

3 討論

通過(guò)對(duì)分離的病原菌進(jìn)行染色鏡檢和PCR鑒定，確診該豬場(chǎng)病豬所得為副豬嗜血桿菌病。

該病給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，加強(qiáng)對(duì)該病的預(yù)防刻不容緩。養(yǎng)殖戶(hù)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理與環(huán)境消毒，注意保溫，減少各種應(yīng)激因素；對(duì)發(fā)病豬群要進(jìn)行緊急預(yù)防接種；在疾病流行期間，有條件的豬場(chǎng)在仔豬斷奶時(shí)可暫時(shí)不混群；在豬群斷奶、轉(zhuǎn)群、混群或運(yùn)輸前后可在飲水中加入維生素C等，同時(shí)在飼料中添加組合藥物。

[1]Olvera A,Cerdà-Cuéllar M,Aragon V.Study of the population structure of Haemophilus parasuis by multilocus sequence typing.Microbiology,2006,152（12）:3683-3690.

[2]斯特勞.豬病學(xué).劉文軍，張中秋，等譯.（第8版）.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998：407-416.

[3]Oliveira S,Galina L,Pijoan C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections.JVet Diagn Invest,2001,13（6）:495-501.

[4]尹秀鳳，姜平，鄧雨修，等.副豬嗜血桿菌病分離與鑒定.畜物與獸醫(yī)，2004，36：6-8.

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2013-01-21