張 巖 李 劼 張銀國(guó)*

（新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子市 832003）

新疆石河子墾區(qū)副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查

張 巖 李 劼 張銀國(guó)*

（新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子市 832003）

通過(guò)對(duì)石河子墾區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)的副豬嗜血桿菌 （Haemophi l us parasuis，Hps）進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，了解了當(dāng)?shù)匾?guī)?；i場(chǎng)副豬嗜血桿菌的流行現(xiàn)狀。調(diào)查結(jié)果顯示，330份血清樣品的Hps抗體陽(yáng)性率為60.30%，豬場(chǎng)感染陽(yáng)性率為91.67%；經(jīng)PCR檢測(cè)，105份病料的陽(yáng)性率為27.62%。

副豬嗜血桿菌；流行病學(xué)；調(diào)查

副豬嗜血桿菌 （Haemophilus parasuis，Hps）可引起豬全身纖維素性多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，主要存在于豬的上呼吸道，是呼吸道綜合癥的主要繼發(fā)細(xì)菌性病原[1]。Hps還可引起敗血癥，并且可能在急性感染后留下后遺癥，即母豬流產(chǎn)、公豬慢性跛行[2]。近年來(lái)，副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率越來(lái)越高，并且Hps強(qiáng)毒在早期斷奶和采用 “三點(diǎn)式”養(yǎng)殖的豬體內(nèi)定居和傳播，可改變副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)特征[3]。所以，要防制豬群感染Hps，首先要了解Hps的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

從墾區(qū)內(nèi)的12個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)隨機(jī)無(wú)菌采集血清，共330頭份；采集具有明顯呼吸道病癥狀的病豬肺臟組織、胸腔積液、心包液等病料105頭份。

1.1.2 主要試劑及儀器

副豬嗜血桿菌間接血凝診斷試劑盒，蘭州獸醫(yī)研究所；副豬嗜血桿菌滅活疫苗，中牧實(shí)業(yè)股份有限公司；PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司。

含5%血清的胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA），胰蛋白大豆肉湯 （Tryptic Soy Broth，TSB），普通瓊脂巧克力平板等，實(shí)驗(yàn)室自制。

TE 溶液、 10×Buffer、 25 mmol/L MgCl2、 2.5mmol/L dNTPs、 2.5U Taq 酶，北京諾維森生物科技有限公司；DL2000 Marker，廣東東盛生物科技有限公司。

1.1.3 引物合成

根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA（M75065）序列設(shè)計(jì)引物[4]，由上海生工生物工程有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段為822 bp。

Hps-16S rRNA上游引物：5’-GG CTTCGTCACCCTCTGT-3’

Hps-16S rRNA下游引物：5’-GT GATGAGGAAGGGTGGTGT-3’

1.2 方法

1.2.1 現(xiàn)場(chǎng)情況調(diào)查

向豬場(chǎng)的工作人員了解發(fā)病豬的年齡、臨床癥狀、發(fā)病率、死亡率以及用藥與治療效果等情況；剖檢可疑病豬，觀察病豬的肺、胸腔、心包膜、關(guān)節(jié)等組織器官的病理變化。

1.2.2 血清抗體檢測(cè)

經(jīng)前腔靜脈無(wú)菌采集豬血 （未注射過(guò)疫苗），待血液靜置凝固后，于離心機(jī)中4 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?。用副豬嗜血桿菌間接血凝診斷試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)。

1.2.3 PCR鑒定

1.2.3.1 病原分離培養(yǎng)

取病豬肺臟、肺淋巴結(jié)、胸腔積液與心包液，接種于含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （NAD）和5%血清的TSA培養(yǎng)基與巧克力平板中，置于燭缸中，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，挑取灰白色透明可疑菌落接種于含有NAD和血清的TSB培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。將純化的細(xì)菌革蘭氏染色，選取兩極濃染短小桿菌進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)與硝酸鹽還原試驗(yàn)，呈陽(yáng)性者初步確定為副豬嗜血桿菌。

1.2.3.2 PCR模板制備

吸取可疑菌液1 mL，滅活疫苗0.5mL（陽(yáng)性對(duì)照），分別置于1.5 mL離心管中，12 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清；沉淀用1mL TE溶液洗滌1～2次，棄上清；用40μL無(wú)菌去離子水將沉淀重懸，置于沸水浴中10分鐘；最后10 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清即為模板。

1.2.3.3 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

反應(yīng)體系（25 μL）：10×Buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、 2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL，10μmol/L上、下游引物各 1μL，模板 5μL，2.5 U Taq酶0.2μL，滅菌去離子水11.8μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃4分鐘，變性94℃ 50秒，退火54℃ 50秒，延伸72℃1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL在1.5%瓊脂糖凝膠中，以電壓100 V電泳40分鐘，凝膠成像觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察結(jié)果

臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、消瘦、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行等 （圖1）。剖檢可見(jiàn)胸膜炎癥狀明顯 （包括心包炎和肺炎），關(guān)節(jié)炎次之，以漿液性、纖維素性滲出為炎癥特征。肺有間質(zhì)水腫、粘連，心包積液、粗糙、增厚，腹腔積液 （圖2）。使用青霉素、土霉素、頭孢菌素類以及慶大霉素等藥物治療可減輕臨床癥狀，但停藥后很快復(fù)發(fā)。

2.2 血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

石河子墾區(qū)規(guī)模豬場(chǎng)中副豬嗜血桿菌病多發(fā)于冬、春季，主要感染斷奶后和保育階段的豬 （40～70日齡），發(fā)病率在10%～35%，死亡率可達(dá)40%。

330 份血清樣品中Hps抗體陽(yáng)性率為 60.30% （199/330），12個(gè)豬場(chǎng)中僅有1個(gè)豬場(chǎng)未檢測(cè)到Hps抗體，豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá) 91.67% （11/12）。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

2.3.1 病原分離培養(yǎng)結(jié)果

注：1.“絨毛心”；2.胸膜粘連；3.被覆薄層纖維蛋白膜的肝臟

在TSA培養(yǎng)基和巧克力平板上均見(jiàn)針尖大小、灰白色透明、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落，染色鏡檢確定為兩極濃染的G-小桿菌。

2.3.2 PCR結(jié)果

經(jīng)PCR鑒定，105份病料中，陽(yáng)性樣品為29份，檢出率27.62% （29/105），部分病料PCR結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 討論

副豬嗜血桿菌病主要感染2周齡至4月齡的青年豬，尤其是哺乳仔豬、斷奶后10天左右的豬更易發(fā)生[5]。此次用于流行病學(xué)調(diào)查的病死豬均為斷奶后的保育豬，即斷奶后10天左右的豬，所以更易發(fā)病，且死亡率較高。未見(jiàn)母豬和育肥豬發(fā)病死亡，其原因尚須進(jìn)一步研究。

血清學(xué)調(diào)查結(jié)果和PCR鑒定結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌在墾區(qū)的抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為60.30%，而PCR鑒定陽(yáng)性率為27.62%，低于抗體檢測(cè)陽(yáng)性率，這可能是由于使用了抗生素，以及副豬嗜血桿菌分離困難等原因所致。加拿大安大略省某實(shí)驗(yàn)室經(jīng)回歸分析法分析顯示，由于部分采集來(lái)的樣品不能確定是否存在副豬嗜血桿菌[6]，導(dǎo)致該病的實(shí)際發(fā)病率可能為報(bào)道的10倍之多。

對(duì)石河子墾區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)的副豬嗜血桿菌病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，石河子墾區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)已存在本病，并已造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。為防止該病的暴發(fā)流行，應(yīng)采取及時(shí)綜合預(yù)防措施，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持環(huán)境衛(wèi)生。

[1]林雪玲，黃耿森，冼瓊珍，等.副豬嗜血桿菌分離鑒定與PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28 （3）：321-324.

[2]馬延慶.副豬嗜血桿菌病的危害與防制.養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2010，（1）：122-123.

[3]薛國(guó)聰，任濤.副豬嗜血桿菌病流行病學(xué)及致病因子的研究進(jìn)展.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（5）：168-171.

[4]Oliveira S，Galina L，Pijoan C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections.J Vet Diagn Invest,2001,13（6）:495-501.

[5]甘孟侯，楊漢春.中國(guó)豬病學(xué).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：327-330.

[6]斯勞特，阿萊爾，蒙加林，等.趙德明，張中秋，沈建忠，等譯.豬病學(xué)（第9版）.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2008：769-776.

S852.61

A

1673-4645（2013）03-0050-02

2013-01-09

張巖 （1987-），男，碩士研究生

張銀國(guó) （1956-），男，教授