唐 文，吳安花，向玲麗，葉合生，胡琦，楊粵軍

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013）

1975年，Goodpasture和Howell 等應(yīng)用銀氨法特異地染色核仁形成區(qū)，證實(shí)銀染的位置是染色體上核糖體基因(rDNA）的位置。此后進(jìn)一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA，也不是rRNA，而可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì)，即和rRNA 轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系的酸性蛋白。核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白（Ag-NORs）是一種酸性非組蛋白C23，在rDNA 轉(zhuǎn)錄活性中起重要調(diào)控作用。核仁組成區(qū)銀染強(qiáng)度反映了rDNA 轉(zhuǎn)錄活性水平，與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)[1],已被不少學(xué)者用于腫瘤的分級(jí)和癌前病變的診斷檢測,對(duì)于良惡性病變的鑒別診斷價(jià)值很大[2]，有人用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白這個(gè)技術(shù)對(duì)比檢測良、惡性骨腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測[3]，也有實(shí)驗(yàn)室用此技術(shù)測量眼組織的活性[4]；還有醫(yī)生以核仁形成區(qū)銀染蛋白的指標(biāo)評(píng)價(jià)腫瘤患者免疫狀況[5]。我們的實(shí)驗(yàn)是采用不同人群的毛囊細(xì)胞，用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白檢測活性，找到他們之間的差異。為進(jìn)一步研究毛囊細(xì)胞活性與毛發(fā)的生長的關(guān)系提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本選擇

年輕男女，小孩，老年男女各50人帶毛囊細(xì)胞的毛發(fā)。

1.2 染色液的制備

2%的白明膠液：取2g 明膠溶于1%甲酸水溶液100mL中混勻。50%硝酸銀水溶液。

1.3 方法

用鑷子取毛囊細(xì)胞的頭發(fā)2～3 根置載玻片中央，加2～3 滴40%醋酸液，室溫放置10 分鐘左右，使毛囊軟化，用刀片刮下毛囊細(xì)胞，棄去頭發(fā)，用刀尖或針尖將毛囊細(xì)胞分散并均勻涂于載玻片中央，在酒精燈上遠(yuǎn)火干燥；加2～3 滴固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），固定15 分鐘，自然干燥；加5N 鹽酸2～3滴，靜置10 分鐘；用蒸餾水沖去蓋玻片及多余染液，自然晾干；將玻片標(biāo)本置入下鋪潮濕吸水紙的容器中，容器放入37℃水浴箱；在標(biāo)本上加染色液2 滴，用洗耳球吹勻，蓋下水浴箱蓋，37℃15 分鐘（此步一定要避光）。

取出標(biāo)本用蒸餾水充分沖洗，干燥后，即可鏡檢觀察。觀察分析：在顯微鏡下可見間期核和中期分裂相的染色體被染成黃色，核仁被染成黑色，某些染色體上有銀染黑點(diǎn)，即核仁形成區(qū)。AgNOR 計(jì)數(shù) 按Crocker 推薦方法[6]油鏡下隨機(jī)數(shù)1100 個(gè)毛囊細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)AgNOR 顆粒數(shù)，求出平均值。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，不同年齡，不同性別，以及頭發(fā)的黑白不同AgNORs 顆粒數(shù)量不同，而且分布也不相同。通過大量實(shí)驗(yàn)大量圖片的比較發(fā)現(xiàn)，黑發(fā)毛囊細(xì)胞中核仁銀染著色比白發(fā)毛囊細(xì)胞中核仁銀染顏色要深；而部分老年白發(fā)毛囊細(xì)胞中可無銀染核仁；成人毛囊細(xì)胞中核仁體積較小孩毛囊細(xì)胞中核仁體積小。

AgNOR 顆粒計(jì)數(shù)：男性組每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)通常只見1～2 個(gè)圓形的黑色銀染小顆粒，可見3 個(gè)，平均1.28±0.47。女性組細(xì)胞核內(nèi)銀染顆粒數(shù)目較多，常為2 個(gè)，可見3～4 個(gè)，平均1.88±0.33。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)AgNOR 顆粒平均數(shù)在男女老少及白發(fā)與黑發(fā)之間，見圖1。統(tǒng)計(jì)的毛囊細(xì)胞銀染核仁數(shù)見表1。

3 討論

Howell 認(rèn)為NOR的銀可染性反映了rRNA 基因的活性。只有有轉(zhuǎn)錄活性或已經(jīng)轉(zhuǎn)錄過的，并且其上仍有殘余的與RNA 相聯(lián)系的蛋白質(zhì)的核仁形成區(qū)才能被銀染色。沒有銀染粒的NOR 可能意味著rDNA 順反子不轉(zhuǎn)錄rRNA，即這些位點(diǎn)沒有與rRNA 相聯(lián)系的銀可染的蛋白質(zhì)。銀染法是目前表征rDNA 基因功能的一個(gè)準(zhǔn)確的方法。人類核糖體RNA 基因位于5 對(duì)近端著絲點(diǎn)染色體短臂的次縊痕處，即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中不是所有核仁形成區(qū)均被銀染，其范圍大約4-10 個(gè)。應(yīng)用銀染法可以覺察正常人體核糖體RNA 基因的活動(dòng)。因此，應(yīng)用銀染核仁形成區(qū)（Ag-NOR）技術(shù)，可以分析有活性的rRNA 基因的動(dòng)態(tài)變化。

圖1 發(fā)毛囊細(xì)胞核中AgNOR 顆粒

表1 不同人群毛囊細(xì)胞活性統(tǒng)計(jì)表

本文觀察到，老年白發(fā)毛囊細(xì)胞的活性最低，年輕男女的毛囊細(xì)胞活性最強(qiáng)，年輕男女之間活性差別不大。各個(gè)不同人群毛囊細(xì)胞活性比較分別是：年輕女黑發(fā)＞年輕男黑發(fā)＞年輕男白發(fā)＞老年黑發(fā)＞年輕女白發(fā)＞小孩黑發(fā)＞老年白發(fā)。

Ag-NORs 是位于某些染色體上特殊部位的核糖體基因rDNA，通過其轉(zhuǎn)錄而形成核糖體RNA，在蛋白質(zhì)合成中起極其重要的作用。研究表明，Ag-NORs 可能就是調(diào)節(jié)rDNA 轉(zhuǎn)錄的聚合酶Ⅰ的亞單位，起保持rDNA 鏈伸展的作用，對(duì)核糖體的形成及細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成至關(guān)重要，可作為rDNA轉(zhuǎn)錄活性的標(biāo)志及蛋白質(zhì)合成的活躍狀態(tài)，來反映核仁結(jié)構(gòu)和功能的變化[7]。Ag-NORs 數(shù)目與細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、染色體核型中帶有NORs 數(shù)目及細(xì)胞周期有著密切的關(guān)系[8]。

毛囊細(xì)胞是決定頭發(fā)生長、濃密程度的關(guān)鍵。普通人的毛發(fā)每28～30天為一個(gè)更新周期，受外環(huán)境及年齡等因素的影響，毛囊非常容易壞死萎縮，導(dǎo)致嚴(yán)重的脫發(fā)問題?？茖W(xué)家經(jīng)過多年的研究，發(fā)現(xiàn)只要再次激活萎縮受損的毛囊，頭發(fā)就能得到重生。而我們用核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白（Ag-NORs），測量男女老少之間、白發(fā)與黑發(fā)之間的毛囊細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)不同人群之間毛囊細(xì)胞活性的變化，為進(jìn)一步研究毛發(fā)的生長提供基礎(chǔ)。

[1]plotton D,Menger M,Jeannesson P.Improvement in the staining visuacization of the argyrophilic proteins of nuceloar organizer regions at the optical level [J].Histochem J,1986,18：5-14.

[2]林其焯,陳立奇,吳衛(wèi).外周淋巴細(xì)胞脫氧核糖核酸蛋白體轉(zhuǎn)錄活性分析[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1996,19 (4),220-222.

[3]齊繼峰,海涌,馬華松.核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白對(duì)良、惡性骨腫瘤檢測的臨床意義[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2001,4,400.

[4]鐘一聲,王康孫.眼組織AgNOR 染色及其意義[J].眼科新進(jìn)展，2000,03,181-183.

[5]孫巍,萬文徽,朱軍,楊江穎,金山.以核仁形成區(qū)銀染蛋白等指標(biāo)評(píng)價(jià)腫瘤患者免疫狀況的研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2003（23），4，270-274.

[6]How should we count AgNORs Proposale for a standarized approach,Crocher J,Boldy DA,Egan MJ.［J］.J Pathol,1989,158(3)：185.

[7]plotton D,Menger M,Jeannesson P,et al.Improvement in the staining visuacization of the argyrophilic proteins of nuceloar organizer regions at the optical level [J].Histochem J,1986,18：5-14.

[8]Underwood JCE,Giri DD.Nucleolar organizer region as diagnostic discrimonants for malignancy [J].J pathol,1988,155(2)：95-96.