陳 潔，沈如娣，王璐楠，顏烯烯，羅 振，王曉明 (臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000)

骨髓是造血組織，其內(nèi)存大量的造血干細(xì)胞，可以分化成多種血細(xì)胞。1976年，F(xiàn)riedenstein在其研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓中除造血干細(xì)胞外還存在著一類(lèi)易于貼附于塑料培養(yǎng)板表面的細(xì)胞，此細(xì)胞具有多分化潛能，是一種干細(xì)胞，稱(chēng)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)［2］。有研究報(bào)道BMSCs在體外培養(yǎng)的情況下，可被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞、骨細(xì)胞等多種成體細(xì)胞［3-5］。由于BMSCs的多分化干細(xì)胞特性及易獲得性，尤其是可誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞的特性，BMSCs在腦與神經(jīng)損傷的臨床細(xì)胞學(xué)治療中極具潛力，也是目前的研究熱點(diǎn)之一。目前關(guān)于誘導(dǎo) BMSCs向神經(jīng)元分化方法較多［2，4，5-7］，多為在體外培養(yǎng)體系加入不同的生長(zhǎng)因子加入誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)效率不一，更為高效率的誘導(dǎo)方法仍在探索中。有研究報(bào)道［6］，表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor，EGF)，在體外培養(yǎng)時(shí)，可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞在體外增殖，是一種必不可少的生長(zhǎng)因子之一。同時(shí)亦有報(bào)道稱(chēng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor，HGF)，在體外培養(yǎng)時(shí)，可以與酪氨酸激酶受體c-Met結(jié)合從而誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(Neuron stem cells，NSCs)存活和分化［8-9］。BMSCs具有神經(jīng)干細(xì)胞的特性，HGF是否可高效的誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化及高效的誘導(dǎo)途徑還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)HGF可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的特性，嘗試誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，擬尋找一種更為高效的BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料:成年Wistar大鼠，購(gòu)自杭州師范學(xué)院動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的獲得及鑒定:將大鼠無(wú)痛處死，去皮、肌肉，分離出股骨，去骺端后，PBS緩沖液沖洗骨髓腔，收集沖洗液，即骨髓溶液，約30 ml，并存儲(chǔ)在含肝素的試管中。吸管反復(fù)吹打，制備成單細(xì)胞懸液，然后緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液(大鼠淋巴細(xì)胞分離液，Histopaque-1083，Sigma)，密度梯度離心，2000 rpm離心20 min。收集細(xì)胞分離液界面處的最上層和單個(gè)核細(xì)胞層，并用20 ml的 PBS再次混合。再次離心，1800 rpm離心5 min，此次只收集單個(gè)核細(xì)胞層。收集得到的細(xì)胞用PBS洗滌2次，1000 rpm/min離心5 min，棄上清，加入L-DMEM完全培養(yǎng)液(DMEM，10%FBS，1×青霉素 -鏈霉素)重懸細(xì)胞。然后，調(diào)細(xì)胞濃度2×105，并接種到培養(yǎng)瓶中(T-75)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每2天換液1次。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是貼壁增殖的細(xì)胞，24 h即可貼壁，貼壁細(xì)胞多為 BMSCs。7～10 d，BMSCs增殖至80% ～90%融合時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，流式細(xì)胞術(shù)鑒定。胰蛋白酶消化3 min左右，培養(yǎng)液終止消化，無(wú)菌吸管沖洗貼壁的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得的細(xì)胞懸液按1∶2傳代，培養(yǎng)7～8 d可傳代1次。傳代細(xì)胞用于誘導(dǎo)分化。

1.2.2 流式細(xì)胞儀鑒定獲得細(xì)胞為BMSCs:取傳代4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到近90%融合時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化3～5 min，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原(abcam公司)CD105-PE(Serotec公司)，CD45-FITC(BD 公司)，CD34-FITC(BD公司)，CD14-FITC(BD公司)的表達(dá)情況。具體操作按操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組:鑒定后的傳代細(xì)胞分為三組:A組，培養(yǎng)體系內(nèi)加入生長(zhǎng)因子HGF;B組，加入EGF和HGF;C組，對(duì)照組，維持傳代培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)體系(DMEM培養(yǎng)基)，不加其他誘導(dǎo)因子。當(dāng)BMSCs增殖至80% ～90%融合時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化、分離，獲得的BMSCs細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至形成1～2簇/cm2。24 h后，當(dāng)BMSCs再次貼壁，并開(kāi)始在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，分別在不同組中加入適量的生長(zhǎng)因子，培養(yǎng)基為DMEM，加入EGF 10 ng/ml(Gibco BRL，Rock ville，MD，USA)，HGF 20 ng/ml(R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA)。換液頻次1 次/3 d，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光染色、WB檢測(cè)BMSCs向神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細(xì)胞分化情況。

1.2.4 免疫熒光染色技術(shù)鑒定分化細(xì)胞為神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細(xì)胞:單孔細(xì)胞培養(yǎng)皿用于此鑒定，誘導(dǎo)分化在此培養(yǎng)皿內(nèi)時(shí)行。取此皿，分化的細(xì)胞已貼附于皿底，PBS洗滌3次，5 min/次，并用4%多聚甲醛PBS溶液固定15 min。然后將其用PBS洗滌2次，5 min/次。然后，樣品用含有1%BSA和0.2%Tri-ton X-100的PBS作用5 min。一抗4℃孵育過(guò)夜?？贵w為:Neuronal Nuclei(NeuN，1∶100，Chemicon Inc.);GFAP(1∶1000，Chemicon Inc.)。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。1.2.5 Western Blotting技術(shù)檢測(cè)分化細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況:各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，經(jīng)冷的0.01 mol/LPBS緩沖液洗3次，離心收集，加細(xì)胞裂解液(50 mM Tris-Cl，pH值 7.4，150 mM NaCl，5%NP-40，1 mM sodium pyrophosphate，2 mM EDTA等)裂解細(xì)胞(1ml細(xì)胞壓積加入6～10 ml裂解液)，輕輕吹打混勻，離心15 min，12000 r，取上清用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)總量，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各組均取等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。取該膜行免疫印跡染色，檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。抗體為:GFAP，Nestin，Gal C(Galactocerebroside)，and NeuN。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的獲得及鑒定:從骨髓中分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞，在L-DMEM培養(yǎng)液(DMEM，10%FBS，1×青霉素-鏈霉素)中培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)。24 h時(shí)，大部分細(xì)胞均已貼壁，細(xì)胞呈圓形，顆粒狀。7 d時(shí)，部分細(xì)胞形態(tài)由顆粒狀開(kāi)始變成梭形;14 d時(shí)呈典型的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，并漸呈漩渦狀聚集，呈簇狀生長(zhǎng)(圖1)。當(dāng)細(xì)胞增殖至80% ～90%融合時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，培養(yǎng)液終止消化，無(wú)菌吸管沖洗貼壁的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得的細(xì)胞懸液按1∶2傳代，傳代細(xì)胞用于誘導(dǎo)分化。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定獲得細(xì)胞為BMSCs:傳代4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到近90%融合時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化3～5 min，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原(abcam公司)CD105-PE(Serotec公司)，及造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物CD45-FITC(BD公司)、CD34-FITC(BD公司)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示99.8%的細(xì)胞呈CD105陽(yáng)性。CD45，CD34，和CD14等抗體呈陰性，提示從骨髓中分離獲得的細(xì)胞中幾乎全部為骨髓間充質(zhì)細(xì)胞。

2.3 免疫熒光染色技術(shù)鑒定分化細(xì)胞為神經(jīng)元或神經(jīng)元樣細(xì)胞:傳代后的BMSCs，經(jīng)EGF和HGF誘導(dǎo)2周后，取單孔培養(yǎng)皿，行免疫熒光染色并在熒光顯微鏡觀察。染色結(jié)果顯示:分化細(xì)胞中，A組和B組GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白)呈弱陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)，但C組(對(duì)照組)呈陰性表達(dá);A組和B組均有NeuN陽(yáng)性表達(dá)，C組仍呈陰性表達(dá)(見(jiàn)圖2)。提示誘導(dǎo)分化的BMSCs已向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。

2.4 Western Blotting技術(shù)檢測(cè)分化細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況:各組分化細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，各組均有Nestin表達(dá);A組及B組均有GFAP、Gal C及NeuN表達(dá)，但C組未見(jiàn)相關(guān)蛋白表達(dá)，且B組NeuN表達(dá)量明顯高于A組(圖3)。

圖1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

3 討論

神經(jīng)元是神經(jīng)組織中的主要細(xì)胞，是一種高度分化的成體細(xì)胞，不可再分裂，損傷后較難恢復(fù)，故此神經(jīng)系統(tǒng)損傷是臨床疾病中較難治療的病癥之一。由于成體神經(jīng)元的不可再生性，目前臨床針對(duì)此類(lèi)疾病的治療多以功能鍛煉以促進(jìn)患者的恢復(fù)。亦有學(xué)者嘗試向患者的損傷部位內(nèi)移植神經(jīng)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，及改善受損部位神經(jīng)元周?chē)h(huán)境，以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞分化，進(jìn)行替代性治療［10-12］。但由于胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞需從胚胎或者成年腦組織中獲得的干細(xì)胞，受法律及倫理限制，相對(duì)較難獲得。BMSCs作為一種骨髓來(lái)源的多能干細(xì)胞，即可以誘導(dǎo)向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，又較易獲得，且可以直接從患者自身獲得，體外誘導(dǎo)后回輸患者，避免了不必要的機(jī)體排斥，是一種較為理想的治療性細(xì)胞。

圖2 免疫熒光染色結(jié)果(×400)

圖3 Western Blotting技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

目前關(guān)于體外誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元分化的報(bào)道較多，多為加入不同的可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣分化的生長(zhǎng)因子，嘗試誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。常見(jiàn)的誘導(dǎo)用生長(zhǎng)因子有VEGF，EGF和BDNF等。本實(shí)驗(yàn)擬嘗試驗(yàn)證其中一種可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的生長(zhǎng)因子，HGF，是否可以誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:我們從骨髓中獲得的大量細(xì)胞基本上均為BMSCs(圖1);當(dāng)加入誘導(dǎo)因子后(HGF或HGF聯(lián)合EGF)，分化細(xì)胞有突起生出，且表達(dá)相關(guān)的神經(jīng)元標(biāo)志物 NeuN(圖2，圖3)，提示 HGF或HGF聯(lián)合EGF均可誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，尤其是HGF聯(lián)合EGF誘導(dǎo)效果較為顯著。其機(jī)制為:①可能與EGF可促進(jìn)干細(xì)胞類(lèi)細(xì)胞增殖有關(guān)，因?yàn)橐酝难芯恳寻l(fā)現(xiàn)BMSCs可表達(dá) EGF 受體［6，13］;②HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)具有多種功能，并在不同上皮細(xì)胞的器官發(fā)生中扮演著重要的角色，包括腎、肺、胃、腸黏膜、角膜以及皮膚表皮和皮下組織的再生［14-15］。同時(shí)在基質(zhì)細(xì)胞，如成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化中也扮演著重要的角色［14］。且HGF是一種腦組均表達(dá)的稀少神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可促進(jìn)海馬和中腦內(nèi)神經(jīng)元的存活能力，并且可誘導(dǎo)新皮層中移植體突起的生長(zhǎng)［16］。具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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