張冬梅 于麗華

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，266021；2.濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院，266071)

ACE基因插入/缺失多態(tài)性與228例原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

張冬梅1于麗華2

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，266021；2.濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院，266071)

目的 探討血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性與青島地區(qū)原發(fā)性高血壓(EH)的發(fā)生以及高血壓分級間的相關(guān)性。方法 選擇青島地區(qū)EH患者228例和119例正常對照，測定兩組血壓、血脂、血糖等臨床及生化指標(biāo)，并對高血壓進(jìn)行分級。采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)，檢測ACE基因型。結(jié)果 EH組與對照組相比，兩組間基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步以性別進(jìn)行分層，男性EH組與男性對照組相比，基因型及等位基因分布頻率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；而女性EH組與女性對照組相比，基因型及等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)合趨勢檢驗，EH組中等位基因D與血壓的分級呈正相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論 ACE基因等位基因D與EH的發(fā)生相關(guān)，尤其與男性EH相關(guān)，并與血壓的分級相關(guān)聯(lián)。

原發(fā)性高血壓；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；基因多態(tài)性

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是由環(huán)境因素、遺傳因素等共同作用引起的一種復(fù)雜性疾病。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水電解質(zhì)平衡的主要系統(tǒng)，是EH發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)作為RAS中的重要組成部分，在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的產(chǎn)生和緩激肽的降解中起關(guān)鍵作用，ACE基因則被認(rèn)為是高血壓的候選基因。研究表明[1]，ACE基因第16內(nèi)含子的插入/缺失(I/D)多態(tài)性與EH相關(guān)聯(lián)。但國內(nèi)外有關(guān)此位點與EH相關(guān)性的研究結(jié)果卻不盡相同[2]?；诖耍狙芯恐荚诹私馇鄭u地區(qū)EH與ACE基因多態(tài)性的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇自2008-01—2012-03在我院首診的EH患者228例，其中男性127例，女性101例；年齡(61.73±10.44)歲。EH的確診符合2010年中國高血壓防治指南[3]診斷標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)血壓水平分級，其中高血壓1級103例、2級83例、3級42例。排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病、腫瘤、糖尿病、腎功能衰竭者、EH家族史者。另選擇健康對照119例，其中男性68例，女性51例；年齡(60.54±9.04)歲，排除標(biāo)準(zhǔn)同上。兩組均為青島地區(qū)常駐居民，無血緣關(guān)系。所有研究對象均經(jīng)詳細(xì)的病史詢問、體格檢查。

1.2 研究方法

1.2.1 BMI、血脂、血糖的檢測 測量研究對象的身高、體質(zhì)量，計算身高體重指數(shù)(BMI)，按體質(zhì)量(kg)/身高(m)2公式計算。隔夜禁食12 h，抽取清晨空腹靜脈血4 mL，采用全自動生化分析儀檢測血漿總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、載脂蛋白A、載脂蛋白B、空腹血糖。

1.2.2 基因型檢測 ①DNA提?。篍DTA抗凝血5 mL，使用天根生物人類基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)進(jìn)行DNA提取，操作過程嚴(yán)格遵守試劑盒說明書要求。②引物設(shè)計：通過互聯(lián)網(wǎng)Genbank數(shù)據(jù)庫查找到公開發(fā)表的ACE基因序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成引物。引序列如下：正向5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′，反向5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′。③PCR擴(kuò)增條件：20 μL反應(yīng)體系，包括寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的SYBR Premix Ex Taq(2x)反應(yīng)液10 μL，PCR Forward Primer(10)1 μL，PCR Reverse primer(10)1 μL，DNA模板2 μL，去離子水6 μL。94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。④ACE基因型判斷及鑒定：同時PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行基因測序，結(jié)果證實該產(chǎn)物與目的基因的片段長度一致。⑤ACE基因型的判斷與鑒定結(jié)果：位于ACE基因內(nèi)含子16的插入或缺失多態(tài)性經(jīng)上述PCR方法檢測后，可擴(kuò)增出兩種長度的片段，即490 bp的插入(I)片段和190 bp缺失(D)片段，紫外燈下可呈現(xiàn)下面3種帶型：單一的490 bp條帶(II基因型)，190 bp和490 bp兩條帶(ID基因型)，單一的190 bp條帶(DD基因型，圖1)。

圖1 1為Marker；2為ID型；3，4，10為DD型；5，6，7，8，9，11為II型；12為Marker

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用表示，經(jīng)Kolmogorov-Smirnov Normality檢驗為正態(tài)分布者，且方差齊者采用t檢驗；偏態(tài)分布者采用Mann-WhitneyU檢驗。應(yīng)用χ2檢驗對Hardy-Weinberg平衡進(jìn)行驗證。等位基因和基因型頻率采用基因計數(shù)法計算。組間等位基因與基因型的頻率分布采用卡方檢驗。所有資料采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間基線水平比較 EH組與對照組相比，總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、載脂蛋白A、載脂蛋白B、BMI、空腹血糖差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而在年齡、性別、低密度脂蛋白、吸煙史、飲酒史上，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

表1 兩組間基線水平比較

2.2 兩組間基因型及等位基因分布頻率比較 ACE基因型分布在兩組間均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P＞0.05)，基因頻率能夠代表群體的基因分布。兩組間基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在對照組中，等位基因I、D頻率為67.2%和32.8%，在EH組中，等位基因I、D頻率為57.5%和42.5%，兩組間I/D等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

在男性對照組中，II型、ID型、DD型頻率分別為50.0%、35.3%和14.7%；而在男性EH患者組II型、ID型、DD型頻率分別為31.5%、43.3%和25.2%，兩組間基因型分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在男性對照組中，等位基因I、D頻率為67.6%和32.4%；在男性EH組中，等位基因I、D頻率為53.1%和46.9%，兩組間I/D等位基因分布頻率差異亦存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

女性在兩組間的基因型及等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表2)。

2.3 EH組不同基因型的血壓水平比較 在EH組中，隨著血壓水平的升高，等位基因D的含量逐漸增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)合趨勢相關(guān)性檢驗，r＝0.240、P＝0.035，表明等位基因D與高血壓的分級呈正相關(guān)(表3)。

表2 兩組間基因型頻率及等位基因頻率比較[例數(shù)(%)]

3 討論

人類ACE基因定位于17q23，為單拷貝基因，全長21 kb，含26個外顯子和25個內(nèi)含子，不同種類的細(xì)胞ACE mRNA是由同一ACE基因在不同部位啟動、轉(zhuǎn)錄而生成。在第16內(nèi)含子內(nèi)有一段287 bp的插入/缺失(I/D)多態(tài)性，此插入序列與人類Alu重復(fù)序列家族有同源性，根據(jù)是否存在或缺失287 bp的Alu重復(fù)序列而分為等位基因I和等位基因D，這兩種等位基因組成II、ID及DD型3種基因型。本研究以中國漢族人群作為研究對象，探討ACE基因I/D多態(tài)性與EH的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)等位基因D與男性EH具有相關(guān)性，與女性EH無相關(guān)性；等位基因D與高血壓的分級呈正相關(guān)。

近年來，多種研究表明，ACE基因I/D多態(tài)性與EH相關(guān)，是EH發(fā)病機(jī)制一種獨立的危險因素[1，4-7]，等位基因D與男性EH密切相關(guān)[8-10]。Ji等[11]對中國漢族人群EH與ACE基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究進(jìn)行了一項薈萃分析，最終納入40項關(guān)于ACE I/D的研究，包括在中國的23個省和特別行政區(qū)的10 547例原發(fā)性高血壓患者和9 217例對照者。結(jié)果表明，基因型DD與EH密切相關(guān)(OR：1.61，95%CI：1.16～2.03，P＝0.002)。其發(fā)生機(jī)制可能為：DD基因型血清水平ACE顯著高于其他兩型，這將對AngⅡ的形成和緩激肽的滅活產(chǎn)生作用，繼而影響機(jī)體內(nèi)醛固酮的分泌、水鈉平衡代謝以及血管收縮和血管平滑肌增生。而這些因素均是導(dǎo)致EH的易發(fā)因素。其次，可能存在其他與ACE基因相連的基因?qū)H產(chǎn)生影響。但是其具體作用機(jī)制，以及DD型如何影響、誘發(fā)EH尚未可知。

但也有一些研究未發(fā)現(xiàn)ACE基因與EH相關(guān)[2，12]。這些矛盾的結(jié)果可能是由于EH是一個由遺傳、環(huán)境因素共同作用引起的復(fù)雜性疾病。同時基因?qū)ρ獕旱挠绊懖⒉蛔袷睾唵蔚拿系聽栠z傳模型。這些互相矛盾的結(jié)果也說明了高血壓單一基因研究的低效性。其次，研究正常人表明，ACE I/D多態(tài)性的基因型的分布存在種族、地域差異，其群體遺傳學(xué)的特點是：白種人等位基因D分布頻率高于等位基因I，黑人等位基因D分布頻率高于等位基因I，而蒙古人種等位基因I分布頻率高于等位基因D。這也是導(dǎo)致結(jié)果不一的因素之一。再次，研究表明[13]，在血壓的測量上，用24 h的動態(tài)血壓比偶測血壓更優(yōu)越，更能科學(xué)的反映研究者的實際血壓情況。而大多數(shù)研究均采用偶測血壓。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)等位基因D與男性EH具有相關(guān)性，與女性EH無相關(guān)性；等位基因D與高血壓的分級呈正相關(guān)。需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，以驗證ACE基因I/D多態(tài)性與EH發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。

[1] Di Pasquale P，Cannizzaro S，Scalzo S，et al.Cardiovascular effects ofI/D angiotensin-converting enzyme gene polymorphism in healthy subjects.Findings afterfollow-up ofsix years[J].Acta Cardiol，2005，60(4)：427-435.

[2] Dzida G，Sobstyl J，Puzniak A，et al.Polymorphisms of angiotensin-converting enzyme and angiotensin IIreceptortype 1 genes in essential hypertension in a Polish population[J].Med Sci Monit，2001，7(6)：1236-1241.

[3]中國高血壓防治指南修訂委員會.中國高血壓防治指南2010[J].中華心血管病雜志，2011，39(7)：579-616.

[4] Yoo JH.Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme isassociated with essentialhypertension in men born during the Pacific War[J].Mech Ageing Dev，2005，126(8)：899-905.

[5]ZaroukWA，Hussein IR，EsmaeilNN，etal.Association of angiotensin converting enzyme gene(I/D)polymorphism with hypertension and type 2 diabetes[J].Bratisl Lek Listy，2012，113(1)：14-18.

[6]Ali A，Alghasham A，Ismail H，et al.ACE I/D and eNOS E298D gene polymorphisms in Saudi subjects with hypertension[J].J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2012[Epub ahead of print].

[7]Abbud ZA，Wilson AC，Cosgrove NM，et al.Angiotensin-convertingenzymegenepolymorphism in systemichypertension[J].Am J Cardiol，1998，81(2)：244-246.

[8]MorshedM，KhanH，AkhteruzzamanS.Association between angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism and hypertension in selected individuals of the Bangladeshi population[J].J Biochem Mol Biol，2002，35(3)：251-254.

[9] Sunder-Plassmann G，Kittler H，Eberle C，et al.Angiotensin converting enzyme DD genotype is associated with hypertensive crisis[J].Crit Care Med，2002，30(10)：2236-2241.

[10] Turner ST，Boerwinkle E，Sing CF.Context-dependent associations of the ACE I/D polymorphism with blood pressure[J].Hypertension，1999，34(4 Pt 2)：773-778.

[11] Ji LD，Zhang LN，Shen P，et al.Association of angiotensinogen gene M235T and angiotensin-converting enzyme gene I/D polymorphisms with essential hypertension in Han Chinese population：a meta-analysis[J].J Hypertens，2010，28(3)：419-428.

[12] Mondorf UF，Russ A，Wiesemann A，et al.Contribution of angiotensin I converting enzyme gene polymorphism and angiotensinogen gene polymorphism to blood pressure regulation in essential hypertension[J].Am J Hypertens，1998，11(2)：174-183.

[13] Shimada K，Kawamoto A，Matsubayashi K，et al.Silent cerebrovascular disease in the elderly.Correlation with ambulatory pressure[J].Hypertension，1990，16(6)：692-699.

Objective To investigate the relationship between angiotensin converting enzyme(ACE)gene insertion/deletion polymorphism and essential hypertension(EH)and different hypertension grades in Qingdao area.Methods 228 essential hypertension sufferers and 119 people with normal blood pressure in Qingdao area were chosen to detect blood pressure，blood lipid，blood glucose and other clinical and biochemical indexes in both groups，and the blood pressure was classified into three grades.The polymerase chain reaction(PCR)technique was adopted to determine ACE gene I/D polymorphism.Results The difference of genotype frequency of ACE gene type was not of statistical significance in EH group and normal group(P＞0.05).The difference of allele frequency was of statistical significance in EH group and normal group(P＜0.05).Hierarchy was further made on the basis of gender.The difference of genotype and allele distribution frequency was of statistical significance between males in EH group and normal group(P＜0.05)，but it was not of statistical significance between females in EH group and normal group(P＞0.05).According to trend test results，the D allele is positively correlated with blood pressure grades in EH group.Conclusion The D allele of ACE is probably involved in the pathogenesis of EH in Qingdao area，especially in males，and also related to blood pressure grades.

Essential hypertension；Angiotensin converting enzyme；Gene polymorphism

1005-619X(2013)12-1059-03

濟(jì)南軍區(qū)科研立項課題(JN11L067)

2013-08-21)