韓瑩，施鵬，王奕丹，閆青爽，韓清，吳璠，張玲*

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧 沈陽 110034;2.沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院婦科;3.沈陽醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)院2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)4班;4.沈陽市文官屯95979部隊(duì)衛(wèi)生教研室)

自從Asahara等首次報(bào)道外周血存在內(nèi)皮祖細(xì)胞 (endothelial progenitor cells，EPCs)且具有分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的潛力以來，對(duì)EPCs促進(jìn)血管再生的研究，尤其是組織缺血所致?lián)p傷后局部EPCs的增殖分化遷移更是倍受青睞［1］。然而EPCs在缺血局部的增殖分化遷移回歸巢數(shù)量從目前實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果看尚不理想，為此，本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察由大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs的生長(zhǎng)過程，對(duì)其進(jìn)行鑒定，建立一套重復(fù)性好、純度高的培養(yǎng)方法，從而為EPCs下一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 3～4周齡Wistar雄性大鼠，體重300～400 g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。纖維連接蛋白 (FN)(美國(guó)BD公司)，優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，EGM培養(yǎng)基試劑盒(美國(guó) Cloncties公司)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) (美國(guó)Peprotech公司)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)(美國(guó) Peprotech公司)，兔抗CD34單克隆抗體、兔抗CD133單克隆抗體 (北京博奧森公司)，兔抗Ⅷ多克隆抗體 (武漢博士德公司)，大鼠淋巴細(xì)胞分離液 (天津?yàn)蠊?，SP試劑盒、兔抗山羊 IgG FITC(Santa Cruz)。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離培養(yǎng) (1)骨髓細(xì)胞的獲取：頸椎脫臼法處死大鼠，75%酒精浸泡消毒后無菌操作，取大鼠股骨、脛骨，將其移入培養(yǎng)液內(nèi)，使其完全浸入防止凝固。用10 ml注射器抽吸培養(yǎng)液，從骨髓腔一端向另一端反復(fù)吹打，直至骨髓腔呈白色。(2)單個(gè)核細(xì)胞的分離：將細(xì)胞混懸液移入試管，1 000 r/min離心10 min。在另一試管中加入淋巴分離液 (密度1.083)5 ml。細(xì)胞混懸液分離后，棄上清，加入PBS 5 ml并充分吹打混勻。將該細(xì)胞混懸液用吸管在淋巴分離液上方2～3 cm處沿管壁緩緩加入盛有淋巴分離液的試管，使二者體積比為1∶1，2 000 r/min離心20 min。用吸管輕輕插到白膜層，沿管壁周緣輕輕吸取白膜。將白膜層吸入另一試管，加入PBS液5 ml，混勻后1 000 r/min離心10 min。(3)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)：離心后棄上清，加入PBS液3 ml，混勻后吸出100 μl，加入 PBS液2 ml中 (1∶20稀釋)，按公式：3 ml溶液所含細(xì)胞總量=鏡下4個(gè)中方格細(xì)胞總數(shù)÷4×20(稀釋倍數(shù)) ×3(液體總量) ×104，計(jì)算分離所得細(xì)胞總數(shù)。同時(shí)在試管內(nèi)追加 PBS液2 ml，1 000 r/min離心10 min。(4)EPCs接種培養(yǎng)：離心后棄全部上清，分別加入1 ml常規(guī)EPCs培養(yǎng)液與特殊EPCs培養(yǎng)液 (含地塞米松和維生素C)中各自混勻，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，吸相應(yīng)數(shù)量的細(xì)胞混懸液到3 ml培養(yǎng)基中，使各自細(xì)胞濃度均達(dá)到4×106/ml，然后將細(xì)胞接種到24孔板上，每孔0.5 ml(1×106/cm2)。放入37℃、5%CO2、飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h半量換液，以后每3 d半量換液1次。(5)EPCs的消化及計(jì)數(shù)：細(xì)胞生長(zhǎng)第7天，取出培養(yǎng)板，先將培養(yǎng)液吸出，D－Hank's液洗2遍，加入0.25%胰酶、0.02%EDTA各0.5 ml，放培養(yǎng)箱3～5 min，并隨時(shí)倒置顯微鏡下觀察，多數(shù)細(xì)胞突起回縮、變圓時(shí)，及時(shí)用等量含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，移入試管，再用D－Hank's液輕輕吹打培養(yǎng)板上仍貼壁細(xì)胞2遍，將洗滌液一同加入試管，1 000 r/min離心10 min。棄上清，PBS洗2遍后，加入1 ml PBS液，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，移植備用。另取部分細(xì)胞加入培養(yǎng)液爬片鑒定。(6)EPCs的爬片和鑒定：將細(xì)胞懸液接種到放有玻片 (預(yù)先鋪一層FN)的6孔板中爬片，在37℃、5%CO2、飽和濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各孔加入PBS洗2遍，取出玻片，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗2遍，干燥后，－20℃冰箱保存或直接免疫組化鑒定。

1.2.2 EPCs鑒定

1.2.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定及生長(zhǎng)曲線測(cè)定 通過光學(xué)顯微鏡觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)1、7、15 d的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。將原代 EPCs制備細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔的密度接種于包被FN的96孔板中，每孔體積200 μl。從1～14 d，隔日隨機(jī)抽取4個(gè)培養(yǎng)孔，每孔加入MTT溶液 (5 g/L)20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸出孔內(nèi)上清，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶能充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)比色，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD值，以時(shí)間為橫軸，吸光值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的為空白對(duì)照孔。

1.2.2.2 免疫組化鑒定 將由FN包被培養(yǎng)4、7、9、14 d的細(xì)胞爬片，爬滿后PBS洗滌，10%中性甲醛固定，按SP試劑盒的說明操作，分別滴加CD34、CD133、vWF、ⅧF一抗，DAB染色，陽性細(xì)胞呈棕黃色。用PBS作陰性對(duì)照。

1.2.2.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞吞噬功能的鑒定 取消化培養(yǎng)的細(xì)胞懸液離心 (4℃，300 r/min，6 min)后去上清，用加入5 ml培養(yǎng)液稀釋并計(jì)數(shù);在細(xì)胞懸液中加入12.5 pg(密度：2.5 pg/mL)的DilacLDL在37℃孵育1h，然后用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS 洗后加入 50 μg(密度：10 μg/ml) 的FITC－UEA－l，37℃孵育1 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察。Dil－acLDL 和 FITC－UEA－1，雙染色陽性細(xì)胞(黃色)被認(rèn)為是正在分化的EPCs。

2 結(jié)果

2.1 EPCs形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況 培養(yǎng)4 d換液去除未貼壁細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)多為短梭型或多角形;培養(yǎng)7 d，梭型細(xì)胞較前增多，形成細(xì)胞團(tuán)，可見集落形成;10 d可見細(xì)胞形成索狀或網(wǎng)狀血管樣結(jié)構(gòu);14 d時(shí)，細(xì)胞呈鵝卵石樣外觀，見圖1。

2.2 免疫組化鑒定 按照上述方法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定，結(jié)果顯示：CD133(+)，CD34(+)，ⅧF(++)，vWF(+)。見圖2。

2.3 EPCs 攝 取 DiL－acLDL，結(jié) 合 FITC－Lectin－UEA－1的實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)細(xì)胞胞漿攝取DiL－acLDL呈紅色，胞膜結(jié)合 FITC－Lectin－UEA－1呈綠色，正在分化的EPCs為黃色。見圖3。

圖3 培養(yǎng)細(xì)胞攝取DiL－acLDL呈紅色 (a)，結(jié)合FITC－Lectin－UEA－1呈綠色 (b)，正在分化的EPCs為黃色 (c)免疫熒光染色(×200)

2.4 大鼠骨髓來源EPCs原代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線分析

大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種后，前3 d細(xì)胞數(shù)量變化不大，生長(zhǎng)較緩慢，為生長(zhǎng)的潛伏期，5～8 d細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度加快，并形成集落，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，9 d后，細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)板底部，進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。見圖4。

圖4 EPCs生長(zhǎng)曲線

3 討論

目前已知，血管再生主要由血管新生 (angiogenesis)與血管發(fā)生 (vasculogenesis)兩部分構(gòu)成，血管新生是指從原有血管的成熟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，以出芽或分裂的方式長(zhǎng)出新的毛細(xì)血管的過程;血管發(fā)生則是指通過來自于循環(huán)中的骨髓起源EPCs，聚集到新生血管的部位并在原位分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，并形成血管的過程［2］。EPCs的增殖分化遷移的潛能及參與組織缺血或損傷后的歸巢、血管新生的作用使其在各種缺血性疾病、血管性損傷以及腫瘤的診治方面，有著廣泛的應(yīng)用前景，進(jìn)一步深入研究EPCs有可能為這些疾病治療開辟新的思路。

從現(xiàn)有研究成果來看，EPCs尚無特異性的表面標(biāo)志，但不同來源、不同發(fā)育階段的EPCs卻具有不全相同的表面標(biāo)志。EPCs分化早期主要表達(dá)CD34和CD133。CD34是干細(xì)胞抗原，除表達(dá)于造血干細(xì)胞外，在成熟內(nèi)皮細(xì)胞也有低水平表達(dá)。它的功能可能是作為造血和內(nèi)皮前體細(xì)胞相互作用的黏附分子，CD34缺失會(huì)導(dǎo)致造血和血管形成缺陷;CD133主要表達(dá)于造血干細(xì)胞和一些前體細(xì)胞，其確切功能尚不清楚，CD133+細(xì)胞具有分化為包括內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的能力。隨著EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，CD133快速丟失，所以CD133對(duì)于鑒定內(nèi)皮細(xì)胞和EPCs具有較高特異性［3］。

利用EPCs表面CD34、CD133標(biāo)志對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分選，在含有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可獲得純度較高的細(xì)胞。但由于缺乏特異的EPCs表面標(biāo)志，對(duì)其判定仍有爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為CD34+細(xì)胞并不是真正的EPCs，而只是可以調(diào)節(jié)血管形成。而且，體外實(shí)驗(yàn)表明只有CD34+和CD34－細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，才能形成血管樣結(jié)構(gòu)。CD34+和CD34－細(xì)胞共同移植于血管損傷動(dòng)物體內(nèi)，比任何一種細(xì)胞單獨(dú)移植都會(huì)產(chǎn)生更多的新血管。因此，CD34+可能并不是EPCs的一個(gè)關(guān)鍵表面標(biāo)志。最近還有研究表明EPCs也可能存在于 CD34－和 CD133－單核細(xì)胞群［4］，F(xiàn)riedrich 等從 CD34+/CD133+/VEGFR－2+前體細(xì)胞中分離出 EPCs，而 Kim等［6］從臍血 CD133+/CD14+細(xì)胞中分離出EPCs。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)采用貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行大鼠骨髓EPCs培養(yǎng)。

體外培養(yǎng)過程中，EPCs對(duì)周圍微環(huán)境的要求很高，除了對(duì)細(xì)胞分離液密度有嚴(yán)格要求外，對(duì)單個(gè)核細(xì)胞懸浮液的離心速度也非常重要，離心速度過快易使細(xì)胞受損，碎片增多成活細(xì)胞減少，離心過慢則會(huì)使單個(gè)核細(xì)胞與其它細(xì)胞混雜，細(xì)胞純度降低。因此掌握適當(dāng)?shù)碾x心速度也是EPCs培養(yǎng)的關(guān)鍵。另外VEGF作為定向分化依賴的特定細(xì)胞因子，通過其高親和力受體作用于內(nèi)皮系細(xì)胞，促進(jìn)其分裂、增殖和遷移，在EPCs的培養(yǎng)中亦不可或缺。

在培養(yǎng)中我們還發(fā)現(xiàn)，單個(gè)核接種密度對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)很重要，當(dāng)接種密度為1×106/cm2時(shí)細(xì)胞貼壁和分化較理想，這說明干細(xì)胞的增殖與分化依賴于細(xì)胞之間的相互作用，一定的接種密度允許細(xì)胞間充分的促進(jìn)作用又不至于過分消耗養(yǎng)分或產(chǎn)生抑制。采取半量換液要比全部換液細(xì)胞生長(zhǎng)好，這說明細(xì)胞可能分泌了一些未知的細(xì)胞因子促進(jìn)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。貼壁對(duì)于EPCs的培養(yǎng)也非常重要，盡管常用的促貼壁物質(zhì)有FN、明膠和貼壁因子等，但由于FN的高糖可增強(qiáng)細(xì)胞間黏連、細(xì)胞與基質(zhì)的黏連，還通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的形狀和細(xì)胞骨架的組織，促進(jìn)細(xì)胞鋪展。因此我們選用PBS稀釋后的FN包被培養(yǎng)板，更有利于細(xì)胞的貼壁，有利于骨髓的單個(gè)核細(xì)胞向EPCs方向發(fā)展。

文獻(xiàn)中應(yīng)用EPCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)間多為培養(yǎng)后7 d左右，鑒定也多于此時(shí)間段進(jìn)行。EPCs的鑒定缺乏特異標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型特征鑒定是常用方法之一。一般認(rèn)為，EPCs表型特征包括：CD34+/CD133+/KDR+(VEGF－2)。但因三者皆為陽性的細(xì)胞數(shù)稀少，研究中多采用CD34+/CD133+、 CD34+/KDR+(VEGF－2) 或CD133+/KDR+(VEGF－2) 細(xì)胞作為 EPCs的標(biāo)志。另一種常用的鑒定方法為攝取DiL－acLDL和結(jié)合 FITC－UEA－1實(shí)驗(yàn)，免疫熒光檢測(cè) DiL－acLDL和FITC－UEA－1雙陽性的細(xì)胞為正在分化的EPCs。本實(shí)驗(yàn)中骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，應(yīng)用DiL－acLDL和FITC－UEA－1免疫熒光染色后，雙陽性細(xì)胞＞90%，10 d時(shí)，雙陽性細(xì)胞仍＞80%，為正在分化的EPCs，說明本實(shí)驗(yàn)所用方法可獲得較高純度的EPCs。無論是骨髓還是外周血EPCs含量都極少，在應(yīng)用EPCs應(yīng)用于疾病治療的前提條件是進(jìn)行體外擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，EPCs的數(shù)量等級(jí)為106，可以達(dá)到實(shí)驗(yàn)研究的需要。

目前，EPCs的分離培養(yǎng)尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)室分離和培養(yǎng)的EPCs方法條件差異較大，所培養(yǎng)的細(xì)胞表型特征和分化潛能亦有差別。本實(shí)驗(yàn)建立了一套較成熟的分離、培養(yǎng)以及鑒定大鼠骨髓來源的EPCs的方法，為進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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