王宇恒，成永霞，艾春雨，孫曉峰，焦晶華，趙宏，王俊科

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110024;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室;3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科)

隨著兒科和產(chǎn)科手術(shù)的發(fā)展，手術(shù)的復(fù)雜程度和持續(xù)時(shí)間都日益增加，吸入全麻藥被越來越多的應(yīng)用于產(chǎn)科和兒科的鎮(zhèn)靜和麻醉。但是近來的研究卻證實(shí)，這些藥物對處于特殊發(fā)育期的動(dòng)物大腦有神經(jīng)毒性作用，且這種毒性作用可引起致青春期和成年期的行為學(xué)改變。為降低麻醉風(fēng)險(xiǎn)，探討吸入麻醉藥對發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)的影響很有必要，且對長期暴露于吸入麻醉藥的孕期的手術(shù)室工作人員亦具有一定的意義。N－甲基－D－天冬氨酸受體 (N－methyl－D－asparate receptor，NMDAR)是皮層、海馬等腦區(qū)廣泛存在的與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的一種受體，在人腦發(fā)育期神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的建立中發(fā)揮了重要的作用［1］。有研究結(jié)果提示高位中樞的NMDAR參與了七氟烷鎮(zhèn)痛作用的調(diào)制過程。本研究觀察大鼠妊娠前后吸入2.4%七氟烷對仔鼠海馬NMDAR的影響，旨在說明妊娠前后吸入七氟烷是否會(huì)影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育，從而產(chǎn)生遠(yuǎn)期可塑性的變化，進(jìn)而影響智力發(fā)育和行為學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 雌性SD大鼠3月齡，體重250～300 g，雄性SD大鼠體重450～500 g(中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，實(shí)驗(yàn)藥物七氟烷為美國百特國際 (Baxter)有限公司生產(chǎn) (批號S062G761)。雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組：對照組(C組)，妊娠前吸入七氟烷組 (BS組)，妊娠期吸入七氟烷組 (PS組)。

1.2 動(dòng)物分組后處理 C組、PS組自由進(jìn)食水，各組雌鼠分別以雌雄2∶1比例與雄鼠合籠過夜。BS組于妊娠前吸入2.4%七氟烷6 h，于100%純氧中復(fù)蘇后，于當(dāng)晚以雌雄2∶1比例與雄鼠合籠過夜。各組雌鼠于次日清晨8時(shí)檢查陰道涂片，以涂片查到精子定為妊娠0天。確定為懷孕的雌鼠單獨(dú)分籠喂養(yǎng)。孕鼠分娩后，保持每只雌鼠至少哺育8只仔鼠。PS組在確定妊娠后，于妊娠6、10、14和18 d分別吸入2.4%七氟烷，左心室穿刺取動(dòng)脈血0.3 ml做血?dú)夥治?。免疫熒光和RT－PCR檢測各組仔鼠出生當(dāng)天(T1)、出生后第7天 (T2)、出生后第14天 (T3)、出生后第28天 (T4)海馬NMDAR(NR1、NR2A、NR2B)的表達(dá)，從每只母鼠哺育的仔鼠中隨機(jī)抽取2只仔鼠，使每組包含12只仔鼠。

1.3 仔鼠海馬中NMDAR的免疫熒光檢測 1∶100稀釋的兔抗大鼠各指標(biāo)的IgG抗體NR1抗體、NR2A抗體、NR2B抗體 (武漢博士德公司產(chǎn)品)，滴加試劑盒中提供的羊抗兔FITC熒光二抗，室溫下孵育，封片，避光保存。在熒光顯微鏡 (IX71 Model，OLYMPUS，日本)下觀察各指標(biāo)免疫熒光結(jié)果，使用圖像采集系統(tǒng) (BX41 Model，OLYMPUS，日本)，采集各指標(biāo)免疫熒光圖像。顯微圖像 分 析 系 統(tǒng) (MetaMorph/C－5050/BX40model，UIC，USA;OLYMPUS，日本)，檢測各指標(biāo)積分光密度值 (IOD值)。

1.4 仔鼠海馬中NMDAR的RT－PCR檢測 引物序列設(shè)計(jì) (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)：NR1 F：5'－TCGCATCATCTCAAACCAGAC－3'R：5－CTCATCT CTAGCCAGGTCTA－3';NR2A F：5'－TTGTTCCCCAAGAGTTTGCTT－3'R：5'－ACTCCACACTGCCCATGAAC－3';NR2B F：5'－TCCAGTTCCTGCAGGGAGTT－3'R：5'－GTTTGATGAAATCGAGCTGGC－3'。兩步法 RT－PCR：依據(jù) TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒 (大連寶生物公司產(chǎn)品)提供說明書進(jìn)行操作KODAKID型凝膠成像，凝膠成像獲取的圖片用 Image Lab軟件進(jìn)行分析，以 NR1、NR2A和NR2B的灰度值與GAPDH灰度值的比值反映NR1 mRNA，NR2A mRNA和NR2B mRNA的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件，正態(tài)分布計(jì)量資料以 (±s)表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

各組隨機(jī)血?dú)夥治龈黜?xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，且組間比較差異無顯著性，見表1。

表1 3組仔鼠血?dú)夥治鲋当容^ (n=6，±s)

表1 3組仔鼠血?dú)夥治鲋当容^ (n=6，±s)

組別pHPaCO2(mmHg)PaO2(mmHg)HCO－3(mmol/L)SaO2(%)T(℃)C組 7.45±0.05 35.7±2.9 94.0±9.2 24.5±3.5 96.0±3.0 37.0±0.3 BS組 7.40±0.07 39.7±7.0 87.0±6.0 28.2±4.0 95.0±3.1 37.1±0.4 PS組 7.38±0.04 38.5±2.9 89.0±7.0 26.0±3.4 94.0±2.0 36.9±0.3

免疫熒光結(jié)果提示：與C組相比，BS組仔鼠海馬NMDAR表達(dá)差異無顯著性 (P＞0.05);PS組仔鼠T1～T3時(shí)NR1和NR2A的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，NR2B表達(dá)顯著降低 (P＜0.01);T4時(shí)NMDAR表達(dá)差異無顯著性，見表2。

表2 3組仔鼠海馬NR1、NR2A及NR2B表達(dá)的比較 (n=12，±s)

表2 3組仔鼠海馬NR1、NR2A及NR2B表達(dá)的比較 (n=12，±s)

注：與C組比較，1)P＜0.01

組別NR1 NR2A NR2B T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 C組 40.8±2.8 42.4±1.8 43.5±2.4 44.2±2.2 49.3±4.2 53.9±1.3 53.8±1.7 54.2±2.1 30.0±3.1 31.2±1.9 30.6±2.9 33.4±2.3 BS組 41.50±2.943.9±2.2 44.3±2.7 43.9±2.2 51.5±3.0 55.3±2.0 55.1±3.9 53.9±2.1 31.4±2.9 30.0±2.3 31.1±2.0 32.7±1.9 PS組 49.4±2.51)49.0±2.01)51.1±1.91)42.8±2.3 61.0±2.71)61.5±2.41)61.1±2.01)53.0±2.2 27.4±1.71)27.8±1.41)28.9±2.71)31.8±3.8

RT－PCR結(jié)果顯示：與C組相比，BS組仔鼠海馬NMDAR mRNA表達(dá)差異無顯著性 (P＞0.05);PS組仔鼠T1～T3時(shí)NR1 mRNA和NR2A mRNA表達(dá)增強(qiáng) (P＜0.01)，NR2B mRNA表達(dá)降低 (P＜0.01)，T4時(shí)NMDAR mRNA表達(dá)差異無顯著性，見表3。

表3 3組仔鼠海馬NR1 mRNA、NR2A mRNA、NR2B mRNA表達(dá)的比較 (n=12，±s)

表3 3組仔鼠海馬NR1 mRNA、NR2A mRNA、NR2B mRNA表達(dá)的比較 (n=12，±s)

注：與C組比較，1)P＜0.01

組別NR1 mRNA NR2A mRNA NR2B mRNA T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 C組 0.863±0.031 0.714±0.024 0.702±0.014 0.678±0.029 0.790±0.026 0.801±0.052 0.744±0.050 0.753±0.074 1.159±0.061 1.130±0.040 1.064±0.019 1.104±0.033 BS組 0.829±0.044 0.707±0.022 0.734±0.023 0.672±0.018 0.766±0.038 0.764±0.044 0.772±0.052 0.741±0.070 1.123±0.085 1.103±0.044 1.049±0.051 1.069±0.064 PS組 0.944±0.0461)0.887±0.0821)0.892±0.0431) 0.653±0.027 0.928±0.0621)0.904±0.0411)0.951±0.0241) 0.712±0.049 0.921±0.0541)0.776±0.0871)0.818±0.0441)1.113±0.021

3 討論

具有發(fā)育毒性的外來化合物與發(fā)育中的胚胎或胎仔接觸，可因胚胎或胎仔所處的發(fā)育階段不同而呈現(xiàn)不同的敏感性。在胚胎發(fā)育后期和新生兒期，最容易表現(xiàn)的發(fā)育毒性是生長遲緩和神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)機(jī)能的改變。在常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，自受精日計(jì)算，大鼠器官發(fā)生期約為9～17 d，大鼠著床前胚泡形成期，自受精日計(jì)算，約為3～4 d，開始著床日約為5.5～6 d。本實(shí)驗(yàn)使用的出生0、7、14、28 d的仔鼠相當(dāng)于新生兒期、兒童期和青年期。本實(shí)驗(yàn)將母體大鼠于妊娠前或妊娠6、10、14、18 d吸入1.6%的異氟烷或2.4%七氟烷，經(jīng)血?dú)夥治鼋Y(jié)果證實(shí)，排除了由于其它原因如缺氧，酸中毒等導(dǎo)致的仔鼠腦發(fā)育異常，成功建立了大鼠吸入麻醉藥模型。

吸入麻醉藥以一種可逆的和劑量依賴性的方式抑制NMDAR。NMDAR在學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要的作用［2－3］。未成熟大腦的快速發(fā)育期即突觸形成期，NMDAR被短暫阻滯后，多個(gè)重要腦區(qū)神經(jīng)元凋亡增加。出生前后NMDAR亞基表達(dá)的進(jìn)行性變化對發(fā)育期突觸塑型起到了重要作用。氯胺酮可引起前腦皮層區(qū)神經(jīng)元凋亡發(fā)生增加，并伴隨著NR1表達(dá)上調(diào)和NR1 mRNA表達(dá)的增加［4－6］。新生大鼠注射NMDAR拮抗劑后，大鼠皮質(zhì)、海馬及齒狀回 NR2A受體都有所增加［7］。Tang［8］發(fā)現(xiàn)NR2B高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠具有超常的學(xué)習(xí)與記憶能力，在多種行為學(xué)測試中表現(xiàn)出良好的學(xué)習(xí)記憶成績，從而提出NR2B與大腦的認(rèn)知密切相關(guān)，并將NR2B命名為“聰明基因”，提出該基因就是記憶基因的論斷。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，母體妊娠6、10、14、18 d吸入2.4%七氟烷6 h，可使仔鼠0、7、14 d海馬NR1、NR2A和NR1 mRNA、NR2A mRNA表達(dá)增多，NR2B和NR2B mRNA的表達(dá)下降，而這種變化于仔鼠出生后28 d消失，提示大鼠于妊娠特定時(shí)間吸入七氟烷6 h可能會(huì)引起仔鼠出生后短期內(nèi)海馬神經(jīng)元凋亡增加和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，并且可能會(huì)影響到仔鼠短期內(nèi)的認(rèn)知功能，而這種影響在仔鼠出生后28 d消失。母體妊娠期吸入麻醉藥引起的子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的形態(tài)學(xué)和行為學(xué)改變有待進(jìn)一步研究。

產(chǎn)科和兒科以鎮(zhèn)靜麻醉為目的的使用NMDAR拮抗劑會(huì)引起相應(yīng)的影響，但其影響是在從嬰兒到成年的各個(gè)時(shí)期內(nèi)逐漸表現(xiàn)出來［9］。七氟烷臨床劑量的使用能否導(dǎo)致未成熟大腦神經(jīng)元的損傷，這種損傷在患者的生命中何時(shí)表現(xiàn)，如何表現(xiàn)都未得到證實(shí)，繼續(xù)深入的進(jìn)行這一研究將會(huì)對產(chǎn)科和兒科麻醉有重要的意義。

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