呂集，劉娜，燕俊青，鄔純鑫，焉再華，杜景新

（吉林省通化市中心醫(yī)院吉林省通化市林蛙研究所，吉林通化 134001）

林蛙卵提取高F值低聚肽混合物的酶解方法

呂集，劉娜，燕俊青，鄔純鑫，焉再華，杜景新

（吉林省通化市中心醫(yī)院吉林省通化市林蛙研究所，吉林通化 134001）

摘 要：以林蛙卵渣作為原料，通過酶解的方法來制備高F值低聚肽，探討短肽復合酶對林蛙卵渣中的蛋白質(zhì)水解進程曲線。結(jié)果表明其最適條件為，底物濃度為3%（g/100 mL）、溫度為50℃、pH8.0、酶添加濃度為2%（質(zhì)量分數(shù)）、時間240 min。然后水解液經(jīng)冷凍干燥得到F值20.18的低聚肽。

關(guān)鍵詞：林蛙卵；高F值低聚肽；酶解

高F值低聚肽混合物是2個～10個氨基酸組成的混合小肽體系，在該混合物中，支鏈氨基酸（BCAA：Val、Ile、Leu）與芳香族氨基酸（AAA：Tyr、Phe）含量的克分子數(shù)比值稱為F值（fischer ratio），其F值應(yīng)在20以上[1]。

高F值低聚肽是一種具有高支鏈氨基酸含量和低芳香族氨基酸含量組成的小肽體系，能夠防治或減輕肝性腦病的功效[2]、可以有效的補充膳食蛋白、改善營養(yǎng)狀態(tài)[3]；而且具有抗疲勞的功能[4]。因此得到了食品與醫(yī)藥界的關(guān)注。

近幾年來，國內(nèi)外不少學者對其進行了研究，并取得了一定的研究進展。1976年，M.Yamashita等首次用胃蛋白酶與鏈酶蛋白酶，從魚蛋白和大豆分離蛋白中，制取了低苯丙氨酸含量的低聚肽混合物[5]；1990年，T.Shinya等采用嗜堿蛋白酶和肌動蛋白酶，降解玉米醇溶蛋白研制出無苦味的高F值低聚肽，F(xiàn)值為20.47[5]；趙豐麗等以米糟蛋白為原料，利用雙酶水解法制備了高F值低聚肽，F(xiàn)值為24.80[6]；鄭慧娜等以馬氏珠母貝肉為原料，制備高F值寡肽的工藝條件進行了優(yōu)化，并研究了其體外抗氧化作用[7]；周敏華等酶解牡蠣肉制備高F值寡肽，F(xiàn)值大于20[8]；趙珊珊等將魔芋飛粉制備成高F值寡肽[9]。這些研究的原料涉及動植物蛋白，說明動植物蛋白均可提取高F值低聚肽。

本實驗以干燥的林蛙卵經(jīng)螺旋壓榨機，經(jīng)壓榨后，過濾得油制備卵油用；而濾渣含蛋白質(zhì)60%以上，所以將其作為原料制備低聚肽，采用短肽復合酶對其進行水解，制備林蛙卵高F值低聚肽。本文重點探討短肽復合酶對林蛙卵渣中蛋白質(zhì)的水解進程，為林蛙卵的進一步深加工，提供生產(chǎn)技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

林蛙卵渣（得到林蛙卵油后的濾渣）、短肽復合酶（130 000 IU/g）（北京市宏潤寶順科技有限公司）、其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型酸度計：雷磁分析儀器廠；DL5M型低溫離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋：金壇市江南儀器廠；FD-4型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；氨基酸自動分析儀：日立；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海比朗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量的測定

采用半微量凱氏定氮法。

1.3.2 林蛙卵渣高F值低聚肽的制備工藝流程

林蛙卵油濾渣→短肽復合酶酶解→滅酶（95℃，15 min）→離心（3 000 r/min，30 min）→上清液→濃縮→冷凍干燥→林蛙卵渣高F值低聚肽

1.3.3 林蛙卵渣高F值低聚肽氨基酸組成測定

用氨基酸自動分析儀進行分析。

1.3.4 水解度（DH%）測定[10]

在pH 7.0～9.0條件下采用簡易的pH-stat法，水解度計算公式：水解度DH%=B（Mb）（1/A）（1/MP）（1/htot）×100

其中：B為NaOH的體積，mL；Mb為NaOH的濃度，（mol/L）；A為α-氨基的解離常數(shù)；MP為蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，本實驗中取htot=8.0[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 短肽復合酶水解林蛙卵渣過程中酶解條件對水解度的影響

2.1.1 底物濃度對水解度的影響

底物濃度對水解度的影響，見圖1。

從圖1可以看出，當?shù)孜餄舛仍?.5%～3%（g/100mL）時，隨著底物濃度的增加，水解度呈現(xiàn)明顯增大的趨勢。但是當?shù)孜餄舛却笥?%時，水解度增大的趨勢消失，有下降的狀態(tài)。這有可能是因為當?shù)孜餄舛冗^高時，不利于短肽復合酶與蛋白質(zhì)的水解，影響其水解度。所以，我們選用底物濃度為3%。

2.1.2 溫度對水解度的影響

溫度對水解度的影響，見圖2。

圖1 短肽復合酶在不同底物濃度下水解進程曲線Fig.1 Curve of the enzymatic hydrolysis process under different substrate concentration

圖2 短肽復合酶在不同溫度下水解進程曲線Fig.2 Curve of the enzymatic hydrolysis process at different temperature

從圖2中可以看出，在35℃時水解度最低；隨著溫度的升高，水解度呈明顯增加的趨勢，在45℃～50℃之間，水解度變化較大，在60℃時，水解度開始有下降的趨勢，這有可能是因為當溫度升高至一定時，酶開始發(fā)生變性，影響了酶與蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)。所以，我們選擇50℃左右的溫度為最適溫度。

2.1.3 pH對水解度的影響

pH對水解度的影響，見圖3。

圖3 短肽復合酶在不同pH下水解進程曲線Fig.3 Curve of the enzymatic hydrolysis process at different pH

從圖3可以看出，開始時，隨著溶液的pH逐漸升高，短肽復合酶對底物的水解度也呈增大趨勢，水解度程度不斷增加；而當pH達到8.5時，水解程度與pH8.0的水解度相似，不再升高；當pH達到9.0時，水解度呈現(xiàn)下降趨勢，這有可能是高pH對短肽復合酶的活性中心產(chǎn)生影響造成的。所以，我們選擇pH 8.0～8.5之間的水解液。

2.1.4 酶添加濃度對水解度的影響

酶添加濃度對水解度的影響，見圖4。

圖4 短肽復合酶在不同酶添加濃度下水解進程曲線Fig.4 Curve of the enzymatic hydrolysis process in different concentration of enzyme addition

從圖4中可以看出，隨著酶添加濃度的增加，短肽復合酶水解林蛙卵渣的水解速度加快。當酶添加濃度在0.5%～2%時，水解度增加很快；當酶添加濃度在2%～7%時，水解度緩慢增加，不是特別快；而2%的酶添加濃度與3%～7%酶添加濃度的水解度很接近，從試驗成本考慮，我們選擇酶添加濃度為2%作為反應(yīng)條件。

2.2 林蛙卵渣F值的測定

采用氨基酸自動分析儀進行氨基酸組成的測定，得到F值20.18。

2.3 林蛙卵高F值低聚肽混合物得率的計算

3 結(jié)論

1）綜合上述條件，低聚肽的制備方法：精密稱取卵渣（底物），置于搪瓷反應(yīng)釜中，底物濃度為3%，攪拌均勻，加溫50℃，調(diào)pH為8.0后，加入底物的2%短肽復合酶，水解240 min，再加溫至95℃，維持15 min后，過濾，取其濾液冷凍干燥，粉碎即得高F值低聚肽混合物，得率56%左右。

2）得到的林蛙卵渣低聚肽的F值達到20.18。

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[1]Fischer J E.The utilization of BCCA in the treatment coma[A].In:Capocaccia L,Fischer J E,Rossi-fanelli F.Hepatic Encephalopathy in Chronic Liver Failure[C].New York:Plenum,1984(3):11-21

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[7]鄭惠娜,章朝樺,吉宏武,等.馬氏珠母貝高F值寡肽體外抗氧化研究[J].食品與機械,2010,26(6):63-66

[8]周敏華,章超樺,曾少葵,等.酶解牡蠣肉制備高F值寡肽的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(7):751-755

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Preparation of Oligo-peptides with High Fischer Ratio by Enzymatic Hydrolysis of Eggs of Rana Temporaria Chensinensis

Lü Ji， LIU Na，YAN Jun-qing， WU Chun-xin，YAN Zai-hua， DU Jing-xin
（The Central Hospital of Tonghua， The Rana Research of Tonghua， Tonghua 134001，Jilin，China）

Abstract：In order to prepare oligo-peptides with high Fischer ratio from eggs of Rana temporaria chensinensis through enzymatic hydrolysis.The enzyme hydrolysis of Eggs of Rana temporaria chensinensis in the process of curve was investigated.The results showed that the optimal hydrolysis conditions were 3%（g/100 mL）substrate concentration，reaction temperature at 50℃，pH 8.0，2%（g/g）enzyme amount and 240 min reaction for hydrolysis.Then the oligo-peptides were by freeze-drying，the final oligo-petedes revealed the Fischer Ratio 20.18.

Key words：Eggs of Rana temporaria chensinensis； high Fischer ratio oligo-peptides； enzymatic hydrolysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.07.031

呂集（1957—），男（漢），主任醫(yī)師，碩士研究生，研究方向：長白山野生動植物研究。

2012-07-20