劉嫻，朱道林，周逢旭，林勝，戴永平，王池麗

（合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物應(yīng)用技術(shù)系，安徽巢湖 238000）

膳食纖維（dietary fiber，DF）是一類不被人體消化酶消化的非淀粉類多糖[1]，膳食纖維分為不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）兩種[2]。膳食纖維可降低血液中膽固醇水平、調(diào)節(jié)血糖、防止便秘、預(yù)防結(jié)腸癌等，在對(duì)抗“文明病”方面起著重要作用[3-8]，被列為人類的“第七大營(yíng)養(yǎng)素”從而受到不同領(lǐng)域的廣泛重視[9]。膳食纖維還有較強(qiáng)的持油、持水力以及增溶和誘導(dǎo)微生物的作用，愈發(fā)引起各國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家的關(guān)注[10]。不溶性膳食纖維可調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)腸胃消化、清除自由基、減肥和抗癌[11-12]。

我國(guó)是大豆的故鄉(xiāng)，是目前世界上非轉(zhuǎn)基因大豆的主要生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)大豆2 000萬t，其副產(chǎn)物豆渣占豆干質(zhì)量15%～20%，每生產(chǎn)1.0 kg豆腐，約產(chǎn)生1.2 kg鮮豆渣。豆渣經(jīng)烘干后，膳食纖維含量高達(dá)50%以上[13]，豆渣中的不溶性膳食纖維含量為36.29%[14]，是生產(chǎn)不溶性膳食纖維的優(yōu)秀原料[15-17]，由于我國(guó)對(duì)豆腐渣的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究還不夠深入，豆渣多被用作飼料或是作為廢棄物處理[18]。把豆渣用于生產(chǎn)IDF，不但做到了廢物利用，而且豆渣來源廣泛，有很好的發(fā)展前景。

不溶性膳食纖維的制備方法很多，如簡(jiǎn)單的水洗法、酸堿法，酶解法或是幾種方法結(jié)合制備，但是用生物發(fā)酵法制備的例子不多，生物發(fā)酵法是制備膳食纖維的一個(gè)新方向，降解過程溫和[19]，且相對(duì)于化學(xué)法和酶法等其他制備方法，產(chǎn)品純度最高，生理活性最好（這在后續(xù)的論文中進(jìn)行闡述）。

本課題以豆渣為原料，用本實(shí)驗(yàn)室篩選的兩種乳酸菌（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）為混合菌種對(duì)豆渣進(jìn)行發(fā)酵，分別從白砂糖的添加量、脫脂乳粉的添加量、混合菌種的接種比例和發(fā)酵液初始pH等方面進(jìn)行研究，確定IDF得率高且品質(zhì)優(yōu)良的最佳發(fā)酵底物組合，以期為豆渣的加工利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

德氏乳桿菌保加利亞亞種：Lactobacillus delbrukeiisubsp.Bulgaricus，Lb；唾液鏈球菌嗜熱亞種：Streptococcus salivariussubsp.Thermophillus，St；凍干管：中國(guó)普通微生物菌種保藏中心購(gòu)買，本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。

1.1.2 原料

伊利脫脂乳粉：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；豆渣：本實(shí)驗(yàn)室制備；北京紅糖坊白砂糖：合肥昌達(dá)食品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

豆渣300.0 g，脫脂乳粉20.0 g，白砂糖10.0 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，95℃水浴滅菌15 min。

1.2 儀器和設(shè)備

SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市杰瑞電器有限公司；YXQ-LS-18SI壓力蒸汽滅菌器筒：上海東亞壓力容器制造有限公司；K-S2-6電熱恒溫水浴鍋、ZHP-100智能恒溫振蕩培養(yǎng)箱、DHG-9101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三發(fā)科學(xué)食品有限公司；SW-JF超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；PHS-2C精密pH計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司；SF-130高速萬能粉碎機(jī)：江蘇泰州制藥機(jī)械廠。

1.3 試劑

無水亞硫酸鈉、石油醚、丙酮、甲苯、中性洗滌劑（乙二胺四乙酸二鈉、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、2-乙氧基乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸）、十氫鈉、α-淀粉酶、pH7.0磷酸緩沖溶液：分析純。

1.4 發(fā)酵工藝流程[2]

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 菌種的活化及發(fā)酵劑的制備

將實(shí)驗(yàn)室篩選的德氏乳桿菌保加利亞亞種、唾液鏈球菌嗜熱亞種斜面分別接入培養(yǎng)基中，接種量5%，37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。然后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，制成生產(chǎn)發(fā)酵劑。

1.5.2 IDF的測(cè)定

按GB 12394-90方法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取1.00 g豆渣于高型無嘴燒杯中，加入100 mL中性洗滌劑和0.5 g無水亞硫酸鈉，電爐加熱5 min～10 min內(nèi)使其煮沸，并保持微沸1 h，趁熱倒入裝有玻璃棉且用110℃烘干至恒重的干燥潔凈耐酸玻璃濾器（m1），抽濾，洗凈濾器下部的液體和泡沫，塞上橡皮塞，加酶液，液面覆蓋纖維，加數(shù)滴甲苯，上蓋表玻皿，37℃培養(yǎng)過夜；抽濾，用熱水分?jǐn)?shù)次洗去殘留酶液，用碘液檢查淀粉是否全部轉(zhuǎn)化，將濾器置烘箱中，110℃烘干至恒重，得m2，計(jì)算得樣品中不溶性膳食纖維的含量。

不溶性膳食纖維的含量=（m2-m1）/m，式中：m是樣品質(zhì)量。

1.5.3 IDF持水力的測(cè)定[20]

準(zhǔn)確稱取1.0g烘干至恒重IDF，加蒸餾水50.0mL，混勻，用磁力攪拌器25℃飽和24 h，3 000 r/min離心30 min，移去上清液，稱重，計(jì)算IDF持水力。

持水力=（樣品濕重-樣品干重）/樣品干重

1.5.4 IDF溶脹性的測(cè)定[20]

準(zhǔn)確稱取1.0 g烘干至恒重IDF于10 mL量筒，加蒸餾水5.0 mL，放置24 h，讀量筒下端IDF體積，并計(jì)算IDF溶脹性。

溶脹性=（溶脹后體積-干品體積）/樣品干重

1.5.5 pH的測(cè)定

用PHS-2C精密pH計(jì)直接讀數(shù)。

1.5.6 單因素及正交試驗(yàn)

試驗(yàn)分別以IDF得率、IDF品質(zhì)（持水力和溶脹性）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過對(duì)白砂糖的添加量、脫脂乳添加量、混合菌種的接種比例、發(fā)酵液初始pH等4種影響因素進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，確定最佳底物構(gòu)成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 白砂糖添加量對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響

將白砂糖分別按2%，4%，6%，8%，10%不同比例添加至發(fā)酵液，在豆渣：水=1：3，脫脂乳粉4%，混合發(fā)酵劑接種量4%，Lb：St=1：1，發(fā)酵液初始pH為6.35的底物條件下，于42℃進(jìn)行徹底發(fā)酵，研究白砂糖對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響。結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，當(dāng)白砂糖添加量為4%時(shí)，IDF得率和持水力最高，當(dāng)白砂糖添加量為6%時(shí)，IDF溶脹性最好。

圖1 白砂糖添加量對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of conversion ratio of IDF and quality on sugar

2.1.2 脫脂乳粉添加量對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響

將脫脂乳粉分別按2%、4%、6%、8%、10%不同比例添加至發(fā)酵液，在豆渣：水=1∶3，白砂糖2%，混合發(fā)酵劑接種量4%，Lb：St=1∶1，發(fā)酵液初始pH為6.35的底物條件下，于42℃進(jìn)行徹底發(fā)酵，研究脫脂乳添加量對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 脫脂乳添加量對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of conversion ratio of IDF and quality on skim milk additives

圖2顯示，當(dāng)脫脂乳添加量為4%時(shí)，IDF得率、持水力和溶脹性均最高。

2.1.3 混合菌種的接種比例對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響

將菌種分別按 Lb：St=1 ∶3，1∶2，1 ∶1，2 ∶1，3 ∶1 的比例接入發(fā)酵液，在豆渣：水=1∶3，脫脂乳粉4%，白砂糖4%，混合發(fā)酵劑接種量4%，發(fā)酵液初始pH為

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.35的底物條件下，于42℃進(jìn)行徹底發(fā)酵，研究混合菌種的接種比例對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響。結(jié)果見圖3。

圖3 混合菌種的接種比例對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of conversion ratio of IDF on mixed bacteria vaccination

由圖3可以看出，當(dāng)Lb：St=1∶1時(shí)，IDF得率、持水力和溶脹性均最高。

2.1.4 發(fā)酵液初始pH對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始 pH 為 6.20，6.25，6.30，6.35，6.40，6.45，在豆渣 ∶水=1∶3，脫脂乳粉4%，白砂糖 4%，混合發(fā)酵劑接種量4%的底物條件下，于42℃進(jìn)行徹底發(fā)酵，研究發(fā)酵液初始pH對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 混合菌種的接種比例對(duì)IDF得率和品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of conversion ratio of IDF on initial pH value

圖4顯示，當(dāng)發(fā)酵液初始pH為6.35時(shí)，IDF得率和溶脹性均最高，此時(shí)IDF持水力也相對(duì)較高。

2.2 發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以IDF得率和IDF品質(zhì)（持水力和溶脹性）為考察指標(biāo)，選取白砂糖的添加量、脫脂乳粉的添加量、混合發(fā)酵劑的接種比例和發(fā)酵液初始pH等4個(gè)因素，選定四因素三水平作正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)水平和正交試驗(yàn)結(jié)果分別見表1和表2。

表1 正交因素水平表Table 1 Factkrs and levels

表2可以看出，4種因素對(duì)IDF得率影響的順序?yàn)镃＞D＞B＞A，即混合菌種的接種比例對(duì)IDF得率影響最大，然后依次是發(fā)酵液初始pH和脫脂乳添加量，對(duì)IDF得率影響最小的是白砂糖添加量，IDF得率指標(biāo)的最優(yōu)組合為A2B2C2D1；因素對(duì)IDF持水力影響的順序?yàn)镃＞B＞A＞D，即混合菌種的接種比例對(duì)IDF持水力影響最大，然后依次是脫脂乳添加量、白砂糖添加量和發(fā)酵液初始 pH，IDF持水力指標(biāo)的最優(yōu)組合為A2B2C2D3；因素對(duì)IDF溶脹性影響的順序?yàn)?A＞C＞B＞D，即白砂糖添加量對(duì)IDF溶脹性影響最大，然后依次是混合菌種的接種比例、脫脂乳添加量和發(fā)酵液初始pH值，IDF溶脹性指標(biāo)的最優(yōu)組合為A1B2C2D2。分析三種指標(biāo)的綜合影響，選取最優(yōu)發(fā)酵底物組合為：A2B2C2D2，即白砂糖添加量4%、脫脂乳粉添加量4%、混合菌種的接種比例Lb：St=1：1、發(fā)酵液初始pH6.35。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，測(cè)得在此底物條件下IDF得率為83.75%，持水力為83.21%，溶脹性為2.9 mL/g。

表2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Design and result of orthogonal experiment

3 結(jié)論

利用大豆制品加工的副產(chǎn)物豆渣生產(chǎn)不溶性膳食纖維，開發(fā)高附加值的功能基料，不僅可以改善人類的營(yíng)養(yǎng)健康水平，也為大豆加工企業(yè)的資源綜合利用提供了新的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)，確定影響IDF得率和IDF品質(zhì)（持水力和溶脹性）最優(yōu)底物構(gòu)成分別是白砂糖添加量4%、脫脂乳添加量4%、混合菌種的接種比例Lb：St=1：1和發(fā)酵液初始pH6.35。此時(shí)IDF得率為83.75%，IDF持水力為83.21%，IDF溶脹性為2.9 mL/g。

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