鄭大貴，祝顯虹，余泗蓮，彭化南，俞飛，毛劉量

（1.上饒師范學(xué)院江西省普通高校應(yīng)用有機化學(xué)重點實驗室，江西上饒 334001；2.百勤異VC鈉有限公司，江西德興 334221）

酶法合成異VC混合脂肪酸酯及其抗氧化性能

鄭大貴1，祝顯虹1，余泗蓮2，彭化南1，俞飛1，毛劉量1

（1.上饒師范學(xué)院江西省普通高校應(yīng)用有機化學(xué)重點實驗室，江西上饒 334001；2.百勤異VC鈉有限公司，江西德興 334221）

摘 要：在Lipozyme 435脂肪酶催化下，利用異VC與山茶油、豬油、麻油和菜籽油分別發(fā)生酯交換反應(yīng)，合成異VC混合脂肪酸酯，產(chǎn)物用柱層析法分離純化。以山茶油與異VC反應(yīng)為例，詳細考察了反應(yīng)溶劑、反應(yīng)時間、反應(yīng)物配比、酶用量和油脂回收循環(huán)使用對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。優(yōu)化條件下，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高達到48%。將合成的異VC山茶油脂肪酸酯、異VC豬油脂肪酸酯、異VC芝麻油脂肪酸酯和異VC菜籽油脂肪酸酯應(yīng)用于新鮮山茶油中，用過氧化值法（POV）進行抗氧化試驗。結(jié)果表明，異VC混合脂肪酸酯是良好的脂溶性抗氧化劑，并表現(xiàn)出明顯的劑效關(guān)系。

關(guān)鍵詞：異VC；脂肪酶；異VC混合脂肪酸酯；油脂；抗氧化性

將VC（L-抗壞血酸）或異VC（D-異抗壞血酸）衍生為高級脂肪酸酯的方法有化學(xué)合成法和生物酶催化法?；瘜W(xué)合成法副反應(yīng)較多，同時不適用于不飽和脂肪酸酯的合成。生物酶催化法具有催化效率高、特異性好、環(huán)境友好等優(yōu)點，已被用于VC脂肪酸酯的合成[1-6]。另外，動植物油脂對人體具有豐富的營養(yǎng)價值，文獻[7-10]公開或報道了利用豬油、棕櫚油和豆油在脂肪酶催化下合成VC混合脂肪酸酯的方法，它們涉及到先將相應(yīng)的油脂與甲醇發(fā)生酯交換反應(yīng)生成混合脂肪酸甲酯，然后利用VC與混合脂肪酸甲酯發(fā)生酯交換反應(yīng)制備VC混合脂肪酸酯，合成和分離純化過程較復(fù)雜。

利用異VC與山茶油、豬油、麻油和菜籽油分別發(fā)生酯交換反應(yīng)，合成異VC混合脂肪酸酯。以山茶油與異VC反應(yīng)為例，考察了反應(yīng)溶劑、反應(yīng)時間、反應(yīng)物配比、脂肪酶用量和油脂回收循環(huán)使用對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，優(yōu)化了合成反應(yīng)條件。將異VC山茶油脂肪酸酯、異VC豬油脂肪酸酯、異VC芝麻油脂肪酸酯和異VC菜籽油脂肪酸酯分別應(yīng)用于新鮮山茶油中，用過氧化值（POV）法進行抗氧化試驗，并與VC棕櫚酸酯、異VC棕櫚酸酯的抗氧化性進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異VC：德興百勤異VC鈉有限公司（≥99.9%）；Lipozyme 435脂肪酶（以下簡稱脂肪酶）：諾維信廣州明遠工貿(mào)有限公司；山茶油、豬油、芝麻油和菜籽油：購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；VC棕櫚酸酯和異VC棕櫚酸酯按照文獻[11]方法合成；其它試劑均為分析純。

SHA-B水浴恒溫搖床：江蘇金壇市金南儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TG328A電光分析天平：上海第二天平儀器廠；DSQ低分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 異VC混合脂肪酸酯的合成和純化

在脂肪酶存在下，異VC與油脂在叔丁醇中發(fā)生酯交換反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，過濾除去脂肪酶和未反應(yīng)的異VC；濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除叔丁醇后加入乙酸乙酯和水，進一步去除其中未反應(yīng)的異VC；乙酸乙酯相用無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，得到粗產(chǎn)物；粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離純化，得到蠟狀固體。

1.2.2 反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的測定

準(zhǔn)確稱取一定量純化后的產(chǎn)物，用95%乙醇溶解后，用碘量法[12]測定并換算成產(chǎn)物中含異VC結(jié)構(gòu)單元（A，mmol數(shù)），計算相對于反應(yīng)所用的異VC物質(zhì)的量（B，mmol數(shù)）的轉(zhuǎn)化率。

1.2.3 抗氧化性能的測試[13]

稱取一定量的抗氧化劑于燒杯中，用少量無水乙醇溶解，然后加入到指定量的新鮮山茶油中，超聲振蕩下使油樣與抗氧化劑混合均勻，放入烘箱中，緩慢加熱并在升溫過程中不斷攪拌，待油樣與抗氧化劑成均相后，恒溫在60℃。每隔12小時充分攪拌1次并交換油樣在烘箱中的位置，每隔48小時取3份平行樣品，按GB/T5009.37-2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》進行POV測定，取平均值。對照樣（CK）為不加任何抗氧化劑，其它操作相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

以下的優(yōu)化條件試驗，我們采用Lipzome 435脂肪酶供應(yīng)商建議的酶促反應(yīng)溫度55℃。每0.88克異VC用反應(yīng)溶劑20 mL。

2.1.1 溶劑種類對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

固定反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間24 h、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、脂肪酶0.132 g、異VC0.88 g和山茶油4.00 g，在20 mL不同的溶劑中反應(yīng)，考察溶劑種類對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見表1。

表1 溶劑種類對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Table 1 The effect of reaction solvents on the conversion

表1的結(jié)果表明，在所選的溶劑中，以叔丁醇的效果最好。以下的實驗選取叔丁醇為反應(yīng)溶劑。

2.1.2 反應(yīng)時間對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

固定反應(yīng)溫度55℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、脂肪酶0.132 g、異VC0.88 g和山茶油4.00 g，在20 mL叔丁醇中反應(yīng)不同的時間，考察反應(yīng)時間對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果見表2。

表2 反應(yīng)時間對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Table 2 The effect of reaction time on the conversion

表2的結(jié)果表明，在給定條件下，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)時間的延長而升高，但30 h以后，升高緩慢。以下的實驗選取反應(yīng)時間30 h。

2.1.3 反應(yīng)物配比對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

固定反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間30 h、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、脂肪酶 0.132 g、異 VC0.88 g（5 mmol），改變山茶油的用量（分別為 3、4、6、8、10 g，假定山茶油的平均分子量為800，然后換算成物質(zhì)量的比），在20 mL叔丁醇中進行反應(yīng)，考察反應(yīng)物配比對反應(yīng)收率的影響。結(jié)果見表3。

表3 反應(yīng)物配比對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Table 3 The effect of the ratio of reactants on the conversion

表3的結(jié)果表明，在給定條件下，反應(yīng)物配比以n（異Vc）∶n（山茶油）=1.0∶1.5時轉(zhuǎn)化率最高。之后，增大山茶油的用量，轉(zhuǎn)化率反而降低，可能的原因是山茶油的用量過大時，反應(yīng)混合物變稠，傳質(zhì)受到影響。

2.1.4 酶用量對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

固定反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間30 h、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、n（異 VC）∶n（山茶油）=1.5∶1.0（異 VC0.88 g，山茶油6.0 g），改變脂肪酶的用量[w（酶）為所用異VC的質(zhì)量百分數(shù)]，在20 mL叔丁醇中進行反應(yīng)，考察酶的用量對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見表4。

表4 酶的用量對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Table 4 The effect of the amount of lipase on the conversion

表4的結(jié)果表明，隨著酶用量的增大，轉(zhuǎn)化率提高。在酶催化反應(yīng)中，酶的用量越大，催化活化中心越多，酶與反應(yīng)底物接觸的機會也越大，酯化反應(yīng)速率加快[14]。

2.1.5 油脂回收循環(huán)使用對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

固定反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間30 h、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、異 VC0.88 g、山茶油 6.0 g、脂肪酶 0.176 g和叔丁醇20 mL的條件下反應(yīng)。用新鮮山茶油和反應(yīng)回收的山茶油的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率分別為45.8%和43.6%；用新鮮豬油和反應(yīng)回收的豬油的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率分別為40.9%和38.70%。結(jié)果表明，用新鮮油脂和用反應(yīng)回收的油脂進行的反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率相差不大，說明油脂可以回收循環(huán)使用。

2.1.6 優(yōu)化條件下的合成結(jié)果及其產(chǎn)物表征

根據(jù)上述優(yōu)化條件，放大實驗，過程及其結(jié)果如下。

具塞錐形瓶中，加入異 VC3.52 g（20 mmol）、新鮮山茶油24.0 g、脂肪酶0.70 g和叔丁醇80 mL，放入恒溫搖床中，在55℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下反應(yīng)30 h。反應(yīng)結(jié)束，過濾去除脂肪酶、旋轉(zhuǎn)蒸餾去除叔丁醇，加入乙酸乙酯80 mL和蒸餾水80 mL，充分攪拌混合后，分出乙酸乙酯層。乙酸乙酯層繼續(xù)用蒸餾水洗至水層至無異VC殘留，無水硫酸鈉干燥，去除乙酸乙酯后得到粗產(chǎn)物25.7 g。

量取約200 mL硅膠，用石油醚濕法裝柱，粗產(chǎn)物直接上柱后，用約300 mL二氯甲烷緩慢洗脫硅膠柱，放干柱中二氯甲烷，截取硅膠柱上端前1/4的硅膠，用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯后用油泵真空干燥0.5 h，得到蠟狀固體4.61 g。碘量法測得含異VC結(jié)構(gòu)單元9.60 mmol，基于異VC的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為48.0%。

合并洗脫硅膠柱的二氯甲烷溶液，常壓蒸除二氯甲烷，得到回收山茶油19.1 g。

用新鮮豬油、芝麻油、菜籽油代替新鮮山茶油，按上述方法進行實驗，結(jié)果見表5。

表5 異VC混合脂肪酸酯合成反應(yīng)結(jié)果Table 5 Synthesis reaction results of D-isoascorbyl mixed-fatty acid esters

經(jīng)柱層析純化的異VC山茶油脂肪酸酯、異VC豬油脂肪酸酯、異VC芝麻油脂肪酸酯和異VC菜籽油脂肪酸酯的EI-MS譜圖分別出現(xiàn)m/z=440、m/z=438、m/z=438和m/z=440的峰。其中，m/z=438為異VC亞油酸酯的分子離子峰，m/z=440為異VC油酸酯的分子離子峰。

2.2 抗氧化性能

2.2.1 不同添加量的異VC山茶油脂肪酸酯在山茶油中的抗氧化性能

以異VC山茶油脂肪酸酯為例進行劑效試驗。將異VC山茶油脂肪酸酯分別以0.013%、0.026%、0.039%和0.052%的添加量加入到新鮮山茶油中，按1.2.4所述方法進行抗氧化試驗，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，與對照樣CK比較，異VC山茶油脂肪酸酯在山茶油中的抗氧化性隨著其添加量的增加而提高，表現(xiàn)出明顯的劑效關(guān)系。這是因為，油樣中異VC山茶油脂肪酸酯的濃度越大，提供的烯二醇結(jié)構(gòu)單元就越多，表現(xiàn)出的抗氧化能力就越強[15]。

2.2.2 不同抗氧化劑抗氧化性能的比較

圖1 不同添加量的異VC山茶油脂肪酸酯在山茶油中的抗氧化性能Fig.1 Antioxidation activities of different amount of D-isoascorbyl camellia oil fatty acid esters in camellia oil

GB2760-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，VC棕櫚酸酯在食用油脂中的最大使用濃度以油脂中VC計為0.02%。參考此用量，根據(jù)有關(guān)化合物的相對分子質(zhì)量（VC棕櫚酸酯和異VC棕櫚酸酯相對分子質(zhì)量為414，假定異VC混合脂肪酸酯平均相對分子質(zhì)量為440）對添加量進行換算后，將異VC山茶油脂肪酸酯、異VC豬油脂肪酸酯、異VC麻油脂肪酸酯、異VC菜籽油脂肪酸酯、VC棕櫚酸酯和異VC棕櫚酸酯分別添加到新鮮山茶油中，按1.2.3所述方法進行抗氧化試驗，結(jié)果見圖2。

圖2 不同異VC混合脂肪酸酯在山茶油中的抗氧化性能Fig.2 Antioxidation activities of different D-isoascorbyl mixedfatty acid esters in camellia oil

圖2的結(jié)果表明，在所試條件下，所有4種異VC混合脂肪酸酯的抗氧化性能均略比VC棕櫚酸酯和異VC棕櫚酸酯的抗氧化性能好；異VC山茶油脂肪酸酯、異VC豬油脂肪酸酯、異VC麻油脂肪酸酯、異VC菜籽油脂肪酸酯之間的抗氧化能力相當(dāng)。

3 結(jié)論

1）在Lipozyme 435脂肪酶催化下，利用異VC與山茶油、豬油、麻油和菜籽油在叔丁醇中分別發(fā)生酯交換反應(yīng)，合成并用柱層析法分離純化了4種異VC混合脂肪酸酯。優(yōu)化了合成反應(yīng)條件，在反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間30 h、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、異VC0.88 g、油脂6.0 g、脂肪酶0.176 g和叔丁醇20 mL的條件下反應(yīng)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最高。

2）抗氧化試驗結(jié)果表明，在以油脂中異VC（或VC）計添加量均為0.02%時，合成的4種異VC混合脂肪酸酯的抗氧化效果相當(dāng)，略優(yōu)于VC棕櫚酸酯和異VC棕櫚酸酯。

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Lipase-catalyzed Synthesis of D-isoascorbyl Mixed-fatty Acid Esters and Their Antioxidation Activities

ZHENG Da-gui1，ZHU Xian-hong1，YU Si-lian2，PENG Hua-nan1，YU Fei1，MAO Liu-liang1
（1.Key Labortatory of Applied Organic Chemistry，Higher Institutions of Jiangxi Province，Shangrao Normal University，Shangrao 334001，Jiangxi，China；2.Parchn Sodium Isovitamin C Co.，Ltd.，Dexing 334221，Jiangxi，China）

Abstract：D-isoascorbyl mixed-fatty acid esters were synthesized with Lipozyme 435 as catalyst by the transesterification of D-isoascorbic acid with camellia oil， lard， sesame oil and canola oil， respectively.The effect of factors such as reaction solvent， reaction time， the ratio of reactants， the amount of lipase， and the recycled oils and fats on the reaction conversion were explored with the synthesis of D-isoascorbyl camellia oil fatty acid esters as reaction model to optimize the reaction conditions.Under the optimized conditions，the reaction conversion could reach 48%.The antioxidation activities of D-isoascorbyl camellia oil fatty acid esters， D-isoascorbyl lard fatty acid esters， D-isoascorbyl sesame oil fatty acid ester and D-isoascorbyl rapeseed oil fatty acid ester in camellia oil was tested by POV determination，respectively.The results showed that all the synthesized D-isoascorbyl mixed-fatty acid esters were excellent fat-soluble antioxidants and that their antioxidation activities increased with the applied concentration.

Key words：D-isoascorbic acid；lipase；D-isoascorbyl mixed-fatty acid ester；oils and fats；antioxidation

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.003

江西省普通高校重點實驗室科技計劃項目（GJJ08523號）；江西省科技條件平臺建設(shè)項目（2010DTZ01900）

鄭大貴（1960—），男（漢），教授，主要從事有機食品添加劑的合成及應(yīng)用研究。

2012-12-22