李書華，趙琦，成英，劉芳

（1.樂山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000；2.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都 610106）

桫欏莖中牡荊素的抑菌活性

李書華1，趙琦2，成英1，劉芳1

（1.樂山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000；2.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都 610106）

摘 要：從體外試驗(yàn)的角度觀察牡荊素的抑菌作用。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌種，采用濾紙片法和試管內(nèi)藥液2倍稀釋法測(cè)定牡荊素的抑菌圈直徑和最低抑菌濃度（Minimal inhibitive concentration，MIC）。牡荊素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑制作用，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為100 μg/mL，對(duì)金色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為25 μg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為100 μg/mL。牡荊素具有良好的體外抑菌作用。

關(guān)鍵詞：牡荊素；抑菌作用；最低抑菌濃度

桫欏（Alsophila spinutosa），又名“樹蕨”、“筆筒樹”，屬蕨類植物門真蕨亞門水龍骨目桫欏科[1]。桫欏的莖干可入藥，在中藥里被稱為龍骨風(fēng)，在民間多用桫欏莖干治療皮膚病[2]。弓加文等首次報(bào)道桫欏葉甲醇提取物對(duì)大腸桿菌有較好的抑制效果，桫欏莖干甲醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌有較好的抑制效果[3]。為了進(jìn)一步明確其抑菌成分，我們對(duì)桫欏莖干甲醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，結(jié)果在其正丁醇萃取物中首次分離得到了兩個(gè)黃酮苷和一個(gè)有機(jī)酸類化合物：牡荊素（vitexin）、異葒草素（isorientin）和 3，4，6-三羥基-1-環(huán)己烯羧酸[4]。通過薄層層析色譜，發(fā)現(xiàn)牡荊素是桫欏莖干中含量最高的黃酮類化合物。據(jù)藥理研究表明：牡荊素具有減輕心肌細(xì)胞損傷，保護(hù)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞等多種藥理活性作用[5-7]，但目前尚未見到牡荊素抑菌活性的研究報(bào)道。為了進(jìn)一步拓展對(duì)牡荊素藥理作用的研究，我們對(duì)桫欏莖干中的牡荊素進(jìn)行了初步的抑菌作用研究。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品：牡荊素，從桫欏莖干的甲醇提取物中分離得到，通過1H-NMR和13C-NMR鑒定其結(jié)構(gòu)[4]。

菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus sutilis）：樂山師范學(xué)院微生物室提供。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

儀器為DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：中儀國(guó)科（北京）科技有限公司；YX-18HM高壓滅菌鍋：上海郢研科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD單人單面潔凈工作臺(tái)：蘇州卓越凈化設(shè)備有限公司；FA2204B分析天平：上海天平儀器廠；MM720微波爐：美的集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度牡荊素溶液的配制

準(zhǔn)確稱取500 mg牡荊素轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，向容量瓶中加入70%的乙醇30 mL，充分振搖，使其溶解，用70%乙醇定容。然后從該溶液中取5.0 mL牡荊素溶液置于50 mL容量瓶中，70%乙醇定容，依法稀釋，配制成5種不同濃度的牡荊素溶液，即1.0、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL。

1.2.2 供試菌株的活化

按照無菌操作要求，將3種供試菌株移接入試管斜面培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）上，在37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h～24 h，重復(fù)活化2次～3次。

1.2.3 菌懸液的制備

用接種環(huán)各挑取一環(huán)菌體分別放入裝有10 mL無菌水的試管里，充分振蕩10 min，使其混勻，再?gòu)脑撘褐腥? mL菌液加入有9 mL無菌水的試管中，依次稀釋，制備出三種濃度梯度的菌懸液，即稀釋成10倍、100倍和1 000倍3個(gè)濃度，備用。

1.2.4 菌懸液濃度的確定

用移液槍精密吸取上述3種不同濃度的菌懸液各4 μL分別滴加于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，涂勻后，放置于37℃生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在稀釋100倍的條件下，生長(zhǎng)菌落比較均勻，有利于下一步的抑菌試驗(yàn)。

1.2.5 抑菌試驗(yàn)

采用濾紙片法測(cè)定牡荊素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用[8]。將直徑為6 mm的濾紙片滅菌后分別浸泡于5種不同濃度的牡荊素溶液中備用，另外用70%乙醇浸泡的濾紙片為對(duì)照。分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面加4 μL各種濃度的3種菌液，用涂布器均勻涂布在培養(yǎng)基表面，在無菌室室溫放置2 min～5 min后，在標(biāo)簽的相應(yīng)位置貼上對(duì)應(yīng)的不同濃度牡荊素溶液浸泡的濾紙片，每菌每一濃度重復(fù)3次，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h～48 h后，準(zhǔn)確測(cè)定其濾紙片周圍抑菌圈直徑的大小，計(jì)算平均直徑，結(jié)果以mm表示。

1.2.6 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用試管內(nèi)藥液2倍稀釋法，即肉湯稀釋法[9]，配制成 200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL共8個(gè)藥物濃度系列。另做不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。將上述試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出試管，以不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照管有細(xì)菌顯著生長(zhǎng)的時(shí)間為觀察和評(píng)定MIC的最佳時(shí)間，以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為受試菌的最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡荊素對(duì)三種菌的抑制作用

根據(jù)1.2.1項(xiàng)下牡荊素溶液的配置方法，得到5種不同濃度的牡荊素溶液，即 1.0、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL；根據(jù)1.2.4項(xiàng)試驗(yàn)確定菌懸液濃度為稀釋100倍；按照1.2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果如表1。

表1 牡荊素對(duì)菌株的平均抑菌圈直徑Table 1 The diameters of inhibition zone of the strains

從表1可以看出，對(duì)照組對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌和枯草芽包桿菌有微弱的抑制作用，而不同濃度的牡荊素對(duì)三種菌則表現(xiàn)出明顯的抑制作用，隨著牡荊素濃度的增加，其抑菌能力增強(qiáng)，即使在低濃度10-4mg/mL時(shí)仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

根據(jù)1.2.6項(xiàng)下試驗(yàn)方法，通過肉眼觀察試驗(yàn)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)牡荊素對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為100 μg/mL，對(duì)金色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為25 μg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為100 μg/mL，由此可知金色葡萄球菌對(duì)牡荊素更敏感。

3 小結(jié)與討論

金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，而大腸桿菌和枯草芽孢桿菌則是條件致病菌。牡荊素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑制作用，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為100 μg/mL，對(duì)金色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為25 μg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為100 μg/mL，金色葡萄球菌對(duì)其更敏感，因此，有必要進(jìn)一步研究該化合物對(duì)金色葡萄球菌的抑菌機(jī)理，為牡荊素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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[1]秦仁昌.中國(guó)植物志(第二卷)[M].北京:科學(xué)出版社,1959:298

[2]新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上海科技出版社,2001:2402

[3]弓加文,陳封政,李書華．桫欏葉和莖干抑菌活性初探[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(33):10566

[4]成英,陳封政,何興金．桫欏莖桿中化合物成分研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(30):18672

[5]Dong L Y,Chen Z W,Guo Y,et al.Mechanisms of vitex in preconditioning effects on cultured neonatal rat cardiomyoeytes with anoxia and reoxygenation[J].Am J Chinese Medicine,2008,36(2):385

[6]董六一,范一菲,邵旭,等．牡荊素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響[J]．中成藥,2011,33(6):1041

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[8]徐叔云,卞如濂,陳修．藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:1651

[9]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1993:259

Antimicrobial Activities of Vitexin from Alsophila spinutosa

LI Shu-hua1，ZHAO Qi2，CHENG Ying1，LIU Fang1
（1.Department of Chemistry and Life Sciences，Leshan Normal University，Leshan 614000，Sichuan，China；2.Institute of Biological Industry ChengDu University，Chengdu 610106，Sichuan，China）

Abstract：To study the antimicrobial activities of vitexin fromAlsophila spinutosa.WithStaphylococcus aureus，Escherichia coliandBacillus sutilisas tested bacterium， the bacteriostatic effects of vitexin fromAlsophila spinulosawere studied by filter paper method and double broth dilution method.The MIC of vitexin onEscherichia coliwas 100μg/mL，the MIC of vitexin onStaphylococcus aureuswas 25μg/mL，and the MIC of vitexin onBacillus sutiliswas 100μg/mL.The vitexin has good bacterostatic action.

Key words：vitexin；bacteriostatic effect；minimal inhibitive concentration

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.002

四川省教育廳資助科研項(xiàng)目（13ZA0105）；四川省旅游發(fā)展研究中心資助項(xiàng)目（LYM12-36）

李書華（1970—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：功能性化學(xué)成分。

2013-01-23