趙 妍，楊 超，王若蘭，宋永令

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001)

果蔬是人類不可或缺的食物資源，因其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而易遭受病害威脅。果蔬的采后病害以真菌性病害最為嚴(yán)重，病原菌侵染果實(shí)，同時(shí)可以分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物，常常引發(fā)食品安全問題［1］。鈣鹽作為一種品質(zhì)保護(hù)劑，常用于果蔬采后貯藏，對(duì)乙烯的生成、呼吸速率和果實(shí)酶的活性有誘導(dǎo)作用［2］。草莓作為典型的非呼吸性躍變型果實(shí)，耐貯藏性較差，果皮薄，果肉含糖量較高，較易發(fā)生采后病害。灰霉病是草莓的常見真菌性病害。本研究探討了CaCl2處理對(duì)草莓采后貯藏品質(zhì)、灰霉病害及果實(shí)抗病相關(guān)物質(zhì)代謝的影響，為其在草莓采后貯藏保鮮方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)用草莓品種為豐香(Toyonoka)，采摘自鄭州市中牟草莓生產(chǎn)基地，采摘后即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。選取成熟度相同且大小一致、無機(jī)械損傷與病蟲害痕跡的草莓為供試果實(shí)。

SYQ－DSX－280B型手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;HW型智能恒溫恒濕箱 寧波東南儀器有限公司;752型紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;GL－20G－Ⅱ型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;101－2型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海浦鴻儀器廠;SW－CJ－1D型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;PHS－3C型酸度計(jì) 上海大普儀器廠;2W型折射儀 上海易測(cè)儀器有限公司;HH－S型恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;PL203電子天平 梅特勒－托利多儀器上海有限公司;CX21型顯微鏡 北京京瑞天下科技有限公司。

病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)分離于自然發(fā)病的草莓果實(shí)，保藏于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。使用前，病原菌活化培養(yǎng)7d，之后用含有0.05%吐溫－20的無菌水沖洗孢子。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用無菌水調(diào)整至濃度為5×104個(gè)/mL的孢子懸浮液，備用。

1.2 草莓果實(shí)預(yù)處理

草莓果實(shí)經(jīng)1%次氯酸鈉溶液消毒1min后，分別浸入濃度為1%、2%、5%和10%的CaCl2溶液中，浸泡10min后取出瀝干，以無菌水浸泡組為對(duì)照。

1.3 果實(shí)主要品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

草莓經(jīng)預(yù)處理后，將果實(shí)置于恒溫恒濕箱中10℃條件下貯藏4d。每組20個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)三次。每天取樣測(cè)定果實(shí)主要品質(zhì)指標(biāo)。維生素C含量采用國標(biāo)GB/T 5009.86－2003測(cè)定。可滴定酸值采用國標(biāo)GB 12293－1990電位滴定法測(cè)定。可溶性固形物含量采用國標(biāo)GB12295－1990折射儀法測(cè)定。

1.4 草莓病害相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 灰霉菌菌落直徑 將灰葡萄孢孢子懸浮液涂布于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d，制成備用平板。配制10倍于待測(cè)濃度的CaCl2溶液，與新配制的PDA培養(yǎng)基以1∶9比例混合均勻，倒皿成含藥平板。之后用打孔器在備用平板邊緣制取直徑為5mm的菌餅，挑取菌餅放入含藥平板中央，長氣生菌絲的一面朝下。以不含CaCl2的平板為對(duì)照。將平板放入27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每種濃度重復(fù)三次。

1.4.2 孢子萌發(fā)率 用CaCl2配制PDB培養(yǎng)基(無瓊脂PDA)，使培養(yǎng)基中CaCl2濃度分別達(dá)到試驗(yàn)所需濃度(1%、2%、5%、10%)，用接種環(huán)挑取灰葡萄孢置于PDB培養(yǎng)基中，25℃下恒溫震蕩培養(yǎng)15h，用無菌滴管吸取培養(yǎng)液滴于載玻片上鏡檢并計(jì)算孢子萌發(fā)率。每種CaCl2濃度下的試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.4.3 果實(shí)發(fā)病率 經(jīng)預(yù)處理草莓果實(shí)于赤道部位打孔(3mm ×3mm)，注入濃度為5×104個(gè)/mL的灰葡萄孢孢子懸浮液15μL，之后果實(shí)貯藏于4℃。15d后測(cè)定果實(shí)發(fā)病率，每種CaCl2處理濃度選取30個(gè)果實(shí)，試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5 誘導(dǎo)抗病性相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定

草莓果實(shí)經(jīng)預(yù)處理后，貯藏于4℃，定期取樣測(cè)定木質(zhì)素含量和苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性。

1.5.1 木質(zhì)素含量測(cè)定 參照Rodrigues［3］方法測(cè)定并作部分修改。稱取果肉組織1g，用95%乙醇進(jìn)行研磨，經(jīng)離心后抽濾，并用乙醇和乙醇－正己烷沖洗，將抽濾之后所得草莓殘?jiān)湃脘X盒，105℃干燥1h。干燥后放入10mL具塞試管中，加入3mL乙酰溴－乙酸(體積比1∶3)的混合試劑，70℃下水浴30min，取出放入冰水中，向試管中加入0.9mL 2mol/L的NaOH以終止反應(yīng)。用冰乙酸定容至10mL，再經(jīng)離心后取上清液0.5mL于10mL具塞試管中定容，混勻后于280nm處測(cè)定其吸光度。結(jié)果用吸光度表示。

1.5.2 PAL、CAT和 POD活性測(cè)定 參考曹建康等［4］編寫的《果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行鄧肯檢驗(yàn)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2處理對(duì)草莓果實(shí)貯藏品質(zhì)的影響

由于呼吸作用和維生素C自身的氧化作用有關(guān)，采后草莓維生素C含量隨貯藏期延長而逐漸下降(圖1A)。CaCl2處理對(duì)果實(shí)維生素C有一定的保持能力，且與處理濃度有關(guān)。在整個(gè)貯藏期內(nèi)，經(jīng)由1%和2%濃度CaCl2處理的果實(shí)其維生素C含量與對(duì)照組無顯著差異;而當(dāng)CaCl2濃度為5%和10%時(shí)，處理組果實(shí)維生素C含量顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)，貯藏4d后，其含量分別為對(duì)照組的1.47倍和1.64倍。說明適宜濃度的CaCl2處理具有提高草莓果實(shí)維生素C含量的作用。

圖1 氯化鈣浸泡處理對(duì)草莓果實(shí)(A)維生素C、(B)可滴定酸及(C)可溶性固形物含量的影響Fig.1 Influence of CaCl2soaking on the(A)vitamin C，(B)titratable acidity and(C)soluble solids contents of strawberry fruit

可滴定酸和可溶性固形物是草莓果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。如圖1B所示，貯藏期間，處理組與對(duì)照組草莓果實(shí)的可滴定酸值均呈先上升后下降的趨勢(shì)。對(duì)照組及低濃度CaCl2處理組(1%和2%)果實(shí)可滴定酸值在貯藏1d后即開始迅速下降;而高濃度CaCl2處理組(5%和10%)果實(shí)可滴定酸值分別在貯藏2和3d后開始下降。說明高濃度CaCl2處理具有延緩草莓果實(shí)可滴定酸含量下降的作用。

同可滴定酸類似，貯藏期間，處理組與對(duì)照組草莓果實(shí)其可溶性固形物含量也呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖1C)。在貯藏期的2～4d，經(jīng)由1%濃度CaCl2處理的果實(shí)其可溶性固形物含量與對(duì)照組無顯著差異，而經(jīng)由2%、5%、10%濃度CaCl2處理的果實(shí)其可溶性固形物含量均顯著地高于對(duì)照組(p＜0.05)。

2.2 CaCl2處理對(duì)灰葡萄孢的控制效果

如表1所示，CaCl2對(duì)灰葡萄孢的菌絲生長、孢子萌發(fā)以及由其侵染所引發(fā)的草莓果實(shí)病害均有顯著影響，且與CaCl2濃度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中，CaCl2濃度與菌落直徑和孢子萌發(fā)率呈線性相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為－0.997(p＜0.01)和－0.943(p＜0.05)。而CaCl2濃度與草莓果實(shí)發(fā)病率則符合生長曲線模型，其回歸模型相關(guān)系數(shù)為0.956(p=0.011)。

表1 氯化鈣處理對(duì)灰葡萄孢的控制效果Table 1 The inhibitory effect of CaCl2to B.cinerea

注:同一列內(nèi)不同小寫字母表示處理間差異達(dá)到顯著水平(p＜0.05)。

2.3 CaCl2處理對(duì)草莓果實(shí)抗病相關(guān)物質(zhì)的影響

2.3.1 木質(zhì)素含量的變化 圖2A所示為CaCl2處理對(duì)草莓果實(shí)木質(zhì)素含量變化的影響。由圖可知貯藏期間，各個(gè)處理組與對(duì)照組草莓果實(shí)木質(zhì)素含量變化趨勢(shì)相同，但高濃度CaCl2處理(5%和10%)可顯著提高果實(shí)木質(zhì)素含量(p＜0.05)，如在貯期第一天，5%和10%CaCl2處理組果實(shí)其木質(zhì)素含量分別為對(duì)照組的2.7倍和3.2倍。說明草莓采后經(jīng)CaCl2處理，能夠誘導(dǎo)其在貯藏期間木質(zhì)素含量的上升。

2.3.2 抗病性相關(guān)酶活性的變化 PAL是多酚類抗病物質(zhì)合成的限速酶，也是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶。由圖2B可知，在貯期的第一天，四個(gè)CaCl2處理組和對(duì)照組果實(shí)均出現(xiàn)了PAL活性高峰，但高濃度CaCl2處理組(5%和10%)果實(shí)其PAL活性均顯著地高于其它三組(p＜0.05)。在貯藏后期(7～9d)，各個(gè)CaCl2處理組與對(duì)照組果實(shí)PAL活性均迅速上

圖2 氯化鈣浸泡處理對(duì)草莓果實(shí)(A)木質(zhì)素含量及(B)PAL、(C)CAT和(D)POD活性的影響Fig.2 Influence of CaCl2soaking on the(A)lignin content，

(B)PAL，(C)CAT and(D)POD activities of strawberry fruit升，這可能是由于貯藏后期病斑直徑擴(kuò)展所致，但各組之間并無顯著差異。

CAT和POD是植物體內(nèi)重要的抗病性相關(guān)酶。如圖2C所示，貯藏期間，草莓果實(shí)CAT活性均呈上升趨勢(shì)，至第6d達(dá)到峰值后迅速下降。高濃度CaCl2處理極大的誘導(dǎo)了CAT活性的上升，在貯期的第6d，10%CaCl2處理組果實(shí)其CAT活性為對(duì)照組的1.44倍。由圖2D可知，各組草莓果實(shí)POD活性在貯藏前期(前3d)均呈上升趨勢(shì)，之后緩慢下降，貯藏后期略有上升，同樣可能是由于果實(shí)病斑直徑擴(kuò)展所致。在整個(gè)貯藏期間，高濃度CaCl2處理組(5%和10%)果實(shí)其POD活性始終保持在較高水平，貯藏后期(9～12d)更是顯著地高于對(duì)照(p＜0.05)。

3 討論

本研究表明草莓果實(shí)在貯藏期間品質(zhì)不斷下降，而CaCl2處理能夠顯著延緩品質(zhì)下降速度，這與前人的研究結(jié)果相一致［5－6］。經(jīng)10%和5%濃度的CaCl2處理后，草莓果實(shí)維生素C下降幅度顯著小于對(duì)照(圖1A)，可滴定酸和可溶性固形物含量在貯藏后期(2～4d)也均顯著的高于對(duì)照(圖1B、圖1C)，這主要與鈣離子能夠穩(wěn)定細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜有關(guān)［7］。此外，CaCl2處理對(duì)灰霉菌的生長有明顯抑制作用，能顯著降低灰葡萄孢菌的菌落直徑和孢子萌發(fā)率，而在體內(nèi)試驗(yàn)中，經(jīng)CaCl2處理過的草莓其灰霉病發(fā)病率顯著低于對(duì)照組(表1)。這說明CaCl2處理能夠減緩采后草莓品質(zhì)下降速度并抑制灰霉病的發(fā)生。

苯丙烷代謝途徑是植物體產(chǎn)生木質(zhì)素和植保素等抗病害物質(zhì)的重要途徑，PAL經(jīng)解氨作用將莽草酸途徑產(chǎn)生的L－苯丙氨酸生成反式肉桂酸從而進(jìn)入苯丙烷代謝。之前研究結(jié)果表明，當(dāng)植物受到誘導(dǎo)和傷害時(shí)防衛(wèi)系統(tǒng)被激活，PAL活性會(huì)迅速上升，同時(shí)產(chǎn)生大量抗病性物質(zhì)如植保素和木質(zhì)素［8］。而木質(zhì)素的合成被認(rèn)為是植物體內(nèi)主動(dòng)防御的表現(xiàn)形式，同時(shí)木質(zhì)素可以通過木質(zhì)化細(xì)胞壁組織達(dá)到抗病菌的目的，是抗病物質(zhì)之一。Ca2+是誘導(dǎo)主動(dòng)防御的激發(fā)子之一，此外，Ca2+被認(rèn)為是植物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)代謝的第二信使，能參與植物體與病害之間的相互作用［9］。本研究結(jié)果表明，在較高濃度CaCl2(10%和5%)影響下，采后草莓PAL活性迅速上升，與對(duì)照組相比差異顯著(圖2B)，同時(shí)果實(shí)木質(zhì)素含量(圖2A)與抗病害能力(表1)顯著上升，確實(shí)起到了防御病害的目的。

CAT和POD是重要的抗病性相關(guān)酶，能夠調(diào)節(jié)植物果實(shí)的活性氧代謝［10］?；钚匝醣l(fā)是果實(shí)被病原菌侵染后所產(chǎn)生的早期反應(yīng)之一，其在植物體內(nèi)有重要的抗病作用，可以直接殺死病原菌，但過高的活性氧濃度同時(shí)會(huì)傷害植物自身細(xì)胞，因此，誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧應(yīng)盡快清除。而CAT可以酶解H2O2，從而調(diào)節(jié)活性氧濃度，POD也是清除H2O2的主要酶類之一［11－12］。之前有研究表明，Ca2+是活性氧爆發(fā)的信號(hào)分子，植物體受到侵害時(shí)活性氧爆發(fā)，同時(shí)引起特異性鈣波，激發(fā)植物體防衛(wèi)功能［13］。本研究結(jié)果表明，在貯藏中后期(6～12d)，10%和5%濃度的CaCl2處理組草莓果實(shí)其CAT和POD活性均不同程度的增加(圖2C、圖2D)，這會(huì)增強(qiáng)果實(shí)對(duì)于活性氧的清除能力，因而可以避免CaCl2誘導(dǎo)所產(chǎn)生的活性氧同時(shí)傷害果實(shí)自身細(xì)胞，有助于延緩果實(shí)老化、保持果實(shí)品質(zhì)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)將草莓果實(shí)在10℃條件下貯藏4d，研究發(fā)現(xiàn)CaCl2處理能夠有效延緩果實(shí)維生素C、可滴定酸及可溶性固形物含量下降，保持果實(shí)品質(zhì);且CaCl2濃度不同，對(duì)于草莓果實(shí)的保鮮效果不同。綜合上述三個(gè)品質(zhì)指標(biāo)分析，經(jīng)10%濃度CaCl2處理的草莓果實(shí)在貯藏期間品質(zhì)最好。

CaCl2處理對(duì)草莓采后灰霉病有較為明顯地抑制作用，且該抑病效果與CaCl2濃度呈正相關(guān)。此外，CaCl2處理可以誘導(dǎo)采后草莓抗病相關(guān)物質(zhì)的積累，同樣，CaCl2濃度不同，對(duì)于果實(shí)抗病性的誘導(dǎo)能力不同。綜合分析，經(jīng)10%濃度CaCl2處理的草莓果實(shí)在貯藏期間木質(zhì)素積累最多、抗病性相關(guān)酶活性變化最顯著。

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