馮曉洲，王為善，任曉慧，劉新利，毛相朝，楊克遷

1 山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353

2 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003

3 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

多殺菌素 (Spinosad) 是由土壤放線菌刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa產(chǎn)生的一類具有觸殺及攝食毒性的新型大環(huán)內(nèi)酯類農(nóng)用抗生素[1-2]，其結(jié)構(gòu)式如圖 1所示。因其具有殺蟲廣譜高效，對(duì)人、非靶標(biāo)動(dòng)物和環(huán)境極為安全，在環(huán)境中快速降解等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，于1999年獲得美國(guó)總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎(jiǎng) (Presidential Green Chemistry Challenge Award)[5]。多殺菌素能有效防治多種害蟲，用藥量極少，持效期長(zhǎng)，且沒有交叉抗性[6-8]，當(dāng)濃度為1 mg/L時(shí)就能有效地保護(hù)谷物至少4個(gè)月，被認(rèn)為是一種極具前景的綠色殺蟲防護(hù)劑[9]。2005年，美國(guó)環(huán)保局 (United States Environmental Protection Agency) 批準(zhǔn)將多殺菌素作為儲(chǔ)糧防護(hù)劑。2008年，歐盟批準(zhǔn)多殺菌素可在有機(jī)作物上使用，多殺菌素已成為目前國(guó)際上最具有發(fā)展前景的生物殺蟲劑。多殺菌素的開發(fā)也是殺蟲劑研究開發(fā)史上最為成功的范例之一。目前，多殺菌素主要由美國(guó)陶氏益農(nóng)公司 (Dow Agrosciences Company) 生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上銷售的多殺菌素產(chǎn)品全部為美國(guó)進(jìn)口。我國(guó)對(duì)多殺菌素的研究還處于實(shí)驗(yàn)室階段，尚無(wú)工業(yè)化生產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道。因此我國(guó)急需加大對(duì)多殺菌素生物合成的相關(guān)研究。

國(guó)外的前期研究已經(jīng)闡明了多殺菌素部分生物合成基因的功能，并且其應(yīng)用研究的成果均已申請(qǐng)了專利保護(hù)。多殺菌素生物合成共涉及23個(gè)基因，這些基因大部分組織成簇排列在長(zhǎng)約80 kb的基因簇中，其基因簇包括Ⅰ型聚酮合成酶 (PKS) 的1個(gè)裝載模件和10個(gè)延伸模件，這些模件的基因按順序頭尾相連，分屬5個(gè)同一轉(zhuǎn)錄方向的開放閱讀框spnA、spnB、spnC、spnD、spnE[10]；聚酮鏈分子內(nèi)交聯(lián)基因spnF、spnL和spnM；鼠李糖后修飾相關(guān)基因和福樂(lè)糖胺后修飾相關(guān)基因[10-12]。但是，NDP-鼠李糖合成基因不在這一基因簇中[13]。至今尚未有多殺菌素生物合成調(diào)控相關(guān)基因的報(bào)道，對(duì)多殺菌素生物合成基因簇的幾個(gè)側(cè)翼基因 (ORF-L15、ORF-L16、ORF-R1和 ORF-R2) 進(jìn)行了序列比對(duì)和研究，最終發(fā)現(xiàn)這些基因與多殺菌素生物合成無(wú)關(guān)[10-11]。

圖1 多殺菌素結(jié)構(gòu)式[1-2] (多殺菌素A (R=H)，多殺菌素D (R=CH3))Fig. 1 The structure of spinosad[1-2]. Spinosyn A (R=H); spinosyn D (R=CH3).

Madduri等[14]將同時(shí)帶有g(shù)tt、gdh和kre基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、整合到菌刺糖多孢菌染色體基因組中，重組菌株多殺菌素的產(chǎn)量提高了近3倍，另外，迄今為止已從菌刺糖多孢菌培養(yǎng)液中分離出 20多種多殺菌素組分，但多殺菌素的殺蟲活性幾乎都是由spinosyn A和spinosyn D組分產(chǎn)生，因此可以通過(guò)抑制多殺菌素次要組分的合成有可能提高spinosad的產(chǎn)量[15]。Jin等[16]采用循環(huán)誘變和理性化定向篩選方法選育菌刺糖多孢菌，成功篩選到抗鼠李糖、抗多殺菌素、抗 2-脫氧葡萄糖的突變菌株。Sheehan等[17]將刺糖多孢菌PKS起始模件替換，構(gòu)建的雜合PKS通過(guò)同源重組整合到刺糖多孢菌染色體上，發(fā)酵工程菌得到了多殺菌素的衍生物，進(jìn)一步在工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加不同羧酸底物獲得了具有新的殺蟲活性的多殺菌素組分，說(shuō)明應(yīng)用組合生物學(xué)方法合成多殺菌素新衍生物是一條切實(shí)可行的途徑。

對(duì)多殺菌素生物合成調(diào)控和代謝的全面認(rèn)識(shí)，是指導(dǎo)理性改造其生物合成的前提。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)生物合成調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了分析，并提出用合成生物學(xué)手段組裝多殺菌素細(xì)胞工廠的策略[18]，另外朱寶利等[19]將刺糖多孢菌合成多殺菌素的基因組測(cè)序，進(jìn)一步為多殺菌素生物合成改造提供便利。本研究旨在對(duì)多殺菌素生物合成基因簇的啟動(dòng)子的分布情況及其轉(zhuǎn)錄時(shí)序特征進(jìn)行深入分析。由于刺糖多孢菌的遺傳操作存在困難，本研究首先建立了基于異源宿主的啟動(dòng)子探測(cè)技術(shù)，對(duì)刺糖多孢菌的基因簇的一些區(qū)域進(jìn)行啟動(dòng)子探測(cè)，確定了基因簇中的一些關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域；接著對(duì)這些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄時(shí)序進(jìn)行了系統(tǒng)分析。通過(guò)以上研究，本工作首次探測(cè)發(fā)現(xiàn)了多殺菌素生物合成基因簇的9個(gè)啟動(dòng)子，并進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)多殺菌素生物合成轉(zhuǎn)錄表達(dá)與后修飾底物鼠李糖的供應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄水平存在不匹配。本研究為對(duì)后續(xù)多殺菌素生物合成調(diào)控的研究提供了思路，也為我們正在進(jìn)行的合成生物學(xué)設(shè)計(jì)多殺菌素生物合成模塊提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosaNRRL18395購(gòu)于 NRRL菌保中心；變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividansTK24，大腸桿菌JM109、ET12567/pUZ8002為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 質(zhì)粒與引物

文章所用質(zhì)粒見表1，引物見表2。

表1 質(zhì)粒特征描述及其來(lái)源Table 1 Plasmids used in this study, characteristics and sources

表2 引物序列及其用途Table 2 Primers and their sequences used in this study

續(xù)表2

1.3 工具酶與化學(xué)試劑

T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)于 NEB公司；熒光定量分析試劑購(gòu)自 Life Technology(ABI) 公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、普通 DNA產(chǎn)物純化試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)于天根公司。

卡那霉素、安普霉素購(gòu)自AMRESCO公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

大腸桿菌培養(yǎng)基 LB，變鉛青鏈霉菌 TK24固體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基[23]。

刺糖多孢菌固體培養(yǎng)基為SGC (玉米淀粉，2.0 g/L；葡萄糖，0.5 g/L；酵母抽提物，0.3 g/L；玉米漿，1.0 g/L ；瓊脂2.0 g/L)，刺糖多孢菌種子培養(yǎng)基為：葡萄糖 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母膏0.3 g/L，胰蛋白營(yíng)養(yǎng)液 (胰蛋白胨1.7 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO40.25 g/L，葡萄糖0.25%)。重組鏈霉菌菌株在培養(yǎng)基上使用的安普霉素終濃度為25 μg/mL。

1.5 質(zhì)粒構(gòu)建

無(wú)啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒 pSneo：以質(zhì)粒pUC119-kmR為模板，用引物neo-F和neo-R擴(kuò)增卡那抗性基因，經(jīng)EcoRⅠ酶切后，插入pSET152的EcoRⅠ和EcoR V位點(diǎn)。

無(wú)啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒pSxylE：以質(zhì)粒pIJ4083為模板，用引物xylE-F和xylE-R擴(kuò)增xylE基因，插入pSET152的EcoR V位點(diǎn)，然后篩選正向插入克隆。

不同啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒的構(gòu)建：以刺糖多孢菌NRRL18395基因組為模板，用表 2引物分別擴(kuò)增多殺菌素生物合成基因簇的各個(gè)啟動(dòng)子，然后經(jīng)NotⅠ酶切后，插入pSneo或者pSxylE，然后篩選正確插入克?。黄渲?，雙向啟動(dòng)子分別篩選正反兩個(gè)方向的克隆，最終得到不同啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒pSneo-PspnA，pSneo-PspnP，pSneo-PspnQ，pSxylE-PspnA，pSxylE-PspnP，pSxylE-PspnQ，pSxylE-PspnG，pSxylE-PspnF，pSxylE-PspnM，pSxylE-PspnO，pSxylE-PspnL，pSxylE-PspnK，pSxylE-PspnJ 和 pSxylE-PspnI。

1.6 抗性梯度比較

通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法將構(gòu)建好的啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變鉛青鏈霉菌TK24中，然后在含有不同卡那霉素濃度 (100～1 000 μg/mL) 的MS固體平板上培養(yǎng)重組菌，從而實(shí)現(xiàn)卡那霉素抗性表達(dá)情況監(jiān)測(cè)。將平板在30 ℃培養(yǎng)4 d觀察結(jié)果。

1.7 菌絲干重測(cè)定方法

細(xì)胞干重采用如下方法計(jì)算：10 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用去離子水清洗1次，然后在70 ℃烘烤48 h，干物質(zhì)用天平稱量，折算成每升的質(zhì)量。

1.8 xylE顯色法比較啟動(dòng)子活性

方法同文獻(xiàn)[24]，取 5 mL發(fā)酵液，10 000 r/min離心5 mim，棄上清，菌體用蒸餾水洗1次，重懸于5 mL冰冷的PEA緩沖液中；細(xì)胞懸浮液置冰上超聲破碎 (4×15 s，間隔30 s)；加入 Triton X-100到終濃度 0.1% (V/V)，10 000 r/min低溫離心5 min；將上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)離心管，冰上放置；取20 μL粗提液加入到1 mL檢測(cè)液 (含0.2 mmol/L鄰苯二酚，之前需30 ℃預(yù)熱) 中并立即混勻；30 ℃溫育10 min 后立即用分光光度計(jì) (島津 BioSpec-mini) 檢測(cè)反應(yīng)液在375 nm處的光吸收。xylE相對(duì)活性計(jì)算方法：樣品xylE活性=A375/mL，突變株發(fā)酵液xylE活性除以出發(fā)菌株的活性，即得突變株 xylE的相對(duì)活性。

1.9 鏈霉菌RNA的制備

刺糖多孢菌總RNA的提取方法同文獻(xiàn)[25]，提取的總RNA經(jīng)RNase-free Dnase (Promega公司) 消化殘留的基因組DNA，并通過(guò)PCR驗(yàn)證其殘留情況。

1.10 多殺菌素的提取

取5.0 mL發(fā)酵液，加入5.0 mL甲醇，充分振蕩，超聲波處理 15 min，室溫下萃取 12 h；8 000 r/min離心10 min；取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取1 mL冷凍離心干燥，重新溶解于100 μL甲醇進(jìn)行HPLC檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件：色譜柱：YMC普通反相 C18柱 (250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈:水=40∶55∶5 (含0.05%的乙酸銨)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器波長(zhǎng)：246 nm；進(jìn)樣量：20 μL (色譜儀配套定量環(huán)為20 μL)；流速：1 mL/min。

1.11 熒光定量PCR分析

2 μg RNA樣品用于cDNA單鏈的反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶用 SuperScript III (Invitrogen公司)，方法同說(shuō)明書。

熒光定量PCR儀器選用ABI 7500，試劑選用 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems公司)。參數(shù)設(shè)置如下：95 10 min℃ ，接著40個(gè)兩步擴(kuò)增循環(huán) (95 ℃變性30 s；60 ℃60 s退火和延伸)。結(jié)果分析用ABI7500 software v2.0.1，內(nèi)參基因選用刺糖多孢菌主要 sigma因子sigA。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒的構(gòu)建

為了探測(cè)刺糖多孢菌中多殺菌素生物合成基因簇的各啟動(dòng)子的位置和相對(duì)活性，本工作首先構(gòu)建了啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒，報(bào)告基因分別選用了卡那霉素抗性基因neo和鄰苯二酚雙加氧酶基因xylE基因?yàn)閳?bào)告基因，構(gòu)建了2個(gè)啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒。如圖2所示，構(gòu)建的2個(gè)啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒選用質(zhì)粒骨架為pSET152。pSET152能夠方便地通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移整合到鏈霉菌基因組的attB位點(diǎn)；另外，由于多殺菌素生物合成基因簇內(nèi)存在幾個(gè)雙向啟動(dòng)子，本工作克隆的啟動(dòng)子長(zhǎng)度有些已延伸到結(jié)構(gòu)基因的ORF內(nèi)部，為了避免結(jié)構(gòu)基因ORF翻譯對(duì)報(bào)告基因的影響，在報(bào)告基因的上游插入了三聯(lián)終止密碼子 (Tri stop codon)，來(lái)終止結(jié)構(gòu)基因 ORF的翻譯；同時(shí)為了比較各啟動(dòng)子的相對(duì)活性，本工作在報(bào)告基因和三聯(lián)終止密碼子之間插入了相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。三聯(lián)終止密碼子和 RBS序列通過(guò)設(shè)計(jì)到報(bào)告基因的上游引物的5端來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.2 多殺菌素生物合成基因簇啟動(dòng)子探測(cè)

刺糖多孢菌中，多殺菌素生物合成基因簇排布[8]如圖 3所示，在整個(gè)簇中，5個(gè)Ⅰ型聚酮鏈合成 ORF同方向緊密排列；而其他大環(huán)內(nèi)酯內(nèi)部交聯(lián)基因和后修飾基因散亂排布，且方向不同。因此，本工作重點(diǎn)探測(cè)了這些散亂排布的基因的啟動(dòng)子。

圖2 啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒示意圖Fig. 2 Genetic maps of integrating plasmids used for promoter detection.

圖3 刺糖多孢菌多殺菌素生物合成基因簇Fig. 3 Organization of spinosad biosynthetic gene cluster.

由于對(duì)刺探多孢菌的遺傳操作存在困難，本工作決定將多殺菌素生物合成基因簇的啟動(dòng)子連入啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入遺傳操作相對(duì)容易的變鉛青鏈霉菌TK24進(jìn)行活性分析。根據(jù)基因排布，選取了多殺菌素生物合成基因簇的spnA、spnP、spnQ、spnG、spnF、spnJ、spnI、spnM、spnO和spnK等10個(gè)基因啟動(dòng)區(qū)進(jìn)行探測(cè)。首先，將這些啟動(dòng)子連入pSneo的NotⅠ位點(diǎn)，結(jié)合轉(zhuǎn)移到TK24菌株后進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些啟動(dòng)子除spnK之外均有不同程度的活性，圖4顯示了spnA、spnP和spnQ等啟動(dòng)子的相對(duì)活性，可以看出spnA啟動(dòng)子的活性相對(duì)較強(qiáng)，spnQ次之，spnP在這 3個(gè)啟動(dòng)子中表現(xiàn)最差。這一結(jié)果表明，本工作建立的啟動(dòng)子探測(cè)方法能夠較好地探測(cè)不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，另外，我們的工作也表明刺糖多孢菌啟動(dòng)子能夠在變鉛青鏈霉菌TK24中進(jìn)行有效評(píng)價(jià)。

為了進(jìn)一步量化各個(gè)啟動(dòng)子的相對(duì)活性，本工作進(jìn)一步將這些啟動(dòng)子連入質(zhì)粒pSxylE，轉(zhuǎn)化TK24后，通過(guò)鄰苯二酚雙加氧酶活性進(jìn)行量化分析。除spnK之外，根據(jù)基因排布預(yù)測(cè)的各啟動(dòng)子均有活性，這與卡那霉素抗性質(zhì)粒檢測(cè)的結(jié)果一致；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，這些啟動(dòng)子的活性并不相同，其中負(fù)責(zé)聚酮鏈合成的第一個(gè)基因spnA的啟動(dòng)子活性最強(qiáng)，其次為spnJ的啟動(dòng)子。然而，spnJ基因上游同向的spnK基因的上游序列用 2個(gè)啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒都沒有發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子活性，這可以判斷spnJ和spnK是共轉(zhuǎn)錄的，而在上游的spnM基因盡管也是和spnJ、spnK同向，用雙報(bào)告質(zhì)粒卻監(jiān)測(cè)到了啟動(dòng)子活性，這表明spnM應(yīng)該是獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的，結(jié)果如圖5所示。

2.3 多殺菌素生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析

2.3.1 轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析培養(yǎng)基確定

初步確定多殺菌素生物合成基因簇的啟動(dòng)子后，繼而進(jìn)一步檢測(cè)在刺糖多孢菌中這些啟動(dòng)子在不同生長(zhǎng)階段的受調(diào)控情況，以在轉(zhuǎn)錄水平上確定限速啟動(dòng)子，為進(jìn)一步工程改造菌種奠定基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)用已經(jīng)建立的種子培養(yǎng)——發(fā)酵兩步發(fā)酵法菌體檢測(cè)到多殺菌素產(chǎn)量比較高，但在菌體接種發(fā)酵培養(yǎng)基后沒有明顯的生長(zhǎng)周期；且發(fā)酵培養(yǎng)基成分復(fù)雜，不溶物質(zhì)較多，不方便取樣和 RNA提取。所以我們嘗試了用種子培養(yǎng)基一步發(fā)酵法，其中測(cè)定了在種子培養(yǎng)基中的菌種生長(zhǎng)和多殺菌素的產(chǎn)量曲線，結(jié)果表明在種子培養(yǎng)基中從第5天完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，而多殺菌素也正是從這個(gè)時(shí)期開始大量積累，到第7天達(dá)到最大值 (圖 6)。

圖4 卡那抗性報(bào)告基因探測(cè)啟動(dòng)子活性Fig. 4 Evaluation of promoter activities by neo reporter gene.

圖5 xylE報(bào)告基因探測(cè)啟動(dòng)子活性Fig. 5 Evaluation of promoter activities by measuring xylE activity.

圖 6 多殺菌素在種子培養(yǎng)基中批次發(fā)酵生長(zhǎng)與多殺菌素產(chǎn)量曲線Fig. 6 Kinetic curves of growth and spinosad production in batch fermentation.

2.3.2 多殺菌素合成基因轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析

根據(jù)生長(zhǎng)曲線和多殺菌素產(chǎn)量曲線，本工作選取了3 d、4 d和5.5 d取樣，提取RNA，通過(guò)熒光定量 PCR進(jìn)行相對(duì)轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析，根據(jù)啟動(dòng)子探測(cè)的結(jié)果，共分析了spnA、spnF、spnG、spnI、spnJ、spnM、spnO、spnP和spnQ9個(gè)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄時(shí)序。結(jié)果見圖 7A，可以發(fā)現(xiàn)這些基因都在菌體進(jìn)入穩(wěn)定期 (5.5 d) 時(shí)轉(zhuǎn)錄有明顯提高，這和發(fā)酵結(jié)果一致；發(fā)酵結(jié)果表明，多殺菌素在5～7 d有明顯的積累。由此可以推測(cè)，刺糖多孢菌中存在控制多殺菌素生物合成基因簇的調(diào)控因素，使整個(gè)基因簇在菌體進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)啟動(dòng)。

另外，多殺菌素生物合成所需的鼠李糖和福樂(lè)糖胺的合成的前體是TDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖，它同時(shí)也是其他脫氧六碳糖的生物合成的共同前體。Krishnamurthy Madduri等[18]發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)合成該前體的基因和負(fù)責(zé)鼠李糖合成的基因不在多殺菌素生物合成基因簇內(nèi)，這些基因?yàn)間tt(TDP-葡萄糖合酶) 、gdh(4,6-葡糖糖脫水酶)epi(3,5-差相異構(gòu)酶) 和kre(4-酮還原酶)，其中g(shù)tt和gdh能夠形成脫氧六碳糖的生物合成的共同前體 TDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖，epi和kre負(fù)責(zé)鼠李糖的合成。我們進(jìn)一步對(duì)這 4個(gè)基因用Real-time PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析。結(jié)果如圖7B所示，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序與多殺菌素生物合成完全不同，它們?cè)趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3～4 d) 具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，而當(dāng)菌體進(jìn)入平臺(tái)期后活性有明顯降低。這表明了多殺菌素生物合成過(guò)程中糖基化后修飾的底物供應(yīng)和聚酮鏈的合成速率不匹配可能是影響產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。在刺糖多孢菌中，鼠李糖不僅參與多殺菌素的合成，還是合成細(xì)胞壁脂多糖的組分，細(xì)胞增長(zhǎng)合成細(xì)胞壁需要大量的脂多糖，而刺糖多孢菌生物量的增加主要在對(duì)數(shù)期，因此我們認(rèn)為刺糖多孢菌中epi和kre在對(duì)數(shù)期具有較高的轉(zhuǎn)錄是完全合理的。但是，這對(duì)多殺菌素的生成卻是不利的，所以我們認(rèn)為通過(guò)恰當(dāng)?shù)氖侄蝸?lái)合理地適配多殺菌素生物合成過(guò)程中聚酮的合成和糖基的合成有可能夠顯著提高其產(chǎn)量。

圖7 多殺菌素轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析Fig. 7 Transcriptional timing analysis of spn at different time points. (A) Genes in the cluster. (B) Genes out of the cluster.

3 結(jié)論

多殺菌素是一種非常重要的農(nóng)用抗生素，它毒殺害蟲迅速，殺蟲范圍廣，對(duì)保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全具有重大的意義。然而野生刺糖多孢菌產(chǎn)生的多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量低，我國(guó)還沒有掌握高產(chǎn)技術(shù)，同時(shí)刺糖多孢菌遺傳操作困難，給我們的代謝工程改造造成一定的困難。

本研究首先從認(rèn)識(shí)多殺菌素生物合成基因簇的啟動(dòng)子出發(fā)，通過(guò)構(gòu)建基于報(bào)告基因neo和xylE的啟動(dòng)子探測(cè)質(zhì)粒，利用異源宿主變鉛青鏈霉菌TK24的易操作特點(diǎn)，建立用于刺糖多孢菌的啟動(dòng)子探測(cè)技術(shù)。并進(jìn)一步利用該技術(shù)，探測(cè)到了多殺菌素生物合成基因簇的9個(gè)基因啟動(dòng)子活性。為了進(jìn)一步分析這些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄時(shí)序，我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析了這 9個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序，同時(shí)還進(jìn)一步分析了不在多殺菌素生物合成基因簇內(nèi)的4個(gè)與糖基化后修飾前體供應(yīng)相關(guān)基因。此外，我們還發(fā)現(xiàn)簇內(nèi)的多殺菌素生物合成相關(guān)基因都是在菌體進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)啟動(dòng)，這暗示著在刺糖多孢菌中，多殺菌素的合成存在調(diào)控因素值得深入認(rèn)識(shí)。我們還發(fā)現(xiàn)，不在多殺菌素生物合成基因簇內(nèi)的4個(gè)糖基化后修飾前體供應(yīng)基因和基因簇內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序相反，它們?cè)诰w生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期有較高的活性，這暗示了多殺菌素聚酮鏈的合成速率和參與后修飾的糖基底物供應(yīng)的最優(yōu)化匹配有可能是代謝工程提高多殺菌素產(chǎn)量的關(guān)鍵。

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