張娜，金子，林影，鄭穗平，韓雙艷

華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006

己二酸二異辛酯 (Diisooctyl adipate，DIOA)的熱穩(wěn)定性及低溫性能好、閃點(diǎn)高、粘度指數(shù)高、揮發(fā)性低，是具有良好生物降解性能及良好潤(rùn)滑性能的綠色潤(rùn)滑油基礎(chǔ)油[1]。利用化學(xué)催化劑和傳統(tǒng)加熱方法合成 DIOA，反應(yīng)溫度較高，物料容易氧化，催化劑自身也容易溶解或分散于物料中，得到的產(chǎn)品存在顏色深、酸值高、品質(zhì)低等問(wèn)題[2]。

采用脂肪酶作為催化劑，具有專一性與選擇性較好，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有一些用脂肪酶合成己二酸酯的研究[3-4]。其中，商品化脂肪酶反應(yīng)效率高，易于回收，但價(jià)格昂貴。利用酵母表面展示技術(shù)，外源脂肪酶可借助錨定于細(xì)胞壁的載體蛋白固定在酵母細(xì)胞表面，類似于酶的固定化[5]。但釀酒酵母表面展示酶存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、效率低的問(wèn)題[5]。采用畢赤酵母能夠高效地表達(dá)外源蛋白，且其高密度發(fā)酵工藝成熟，易得到大量展示有CALB的酵母細(xì)胞，經(jīng)過(guò)冷凍干燥或噴霧干燥即可作為生物催化劑進(jìn)行使用[6]。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室自制的表面展示 CALB的畢赤酵母細(xì)胞為催化劑合成DIOA，初步探索該合成反應(yīng)的最優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母表面展示脂肪酶為本實(shí)驗(yàn)室自制[8]。己二酸二異辛酯購(gòu)于西格瑪奧德里奇 (上海) 貿(mào)易有限公司，其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 酵母表面展示脂肪酶的制備

按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.2.2 酵母表面展示脂肪酶和底物的水活度預(yù)平衡

按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.2.3 酯化反應(yīng)及產(chǎn)率的計(jì)算

所有反應(yīng)均在恒溫振蕩搖床中進(jìn)行，首先以一定的摩爾比將己二酸和異辛醇加入 50 mL具塞三角瓶中，再加入一定體積的有機(jī)溶劑，充分混和后加入一定質(zhì)量的酵母表面展示脂肪酶，在特定的溫度下反應(yīng)48 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。用氣相色譜測(cè)定酯化反應(yīng)的產(chǎn)率。反應(yīng)初速度的計(jì)算及200 mL的放大反應(yīng)按照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.2.4 氣相色譜分析

采用安捷倫 7890A氣相色譜儀 (氫火焰離子檢測(cè)器，DB-FFAP毛細(xì)管柱)。分析條件：載氣 (氮?dú)? 流速20 mL/min，干燥空氣流速400 mL/min，氫氣流速 30 mL/min。柱溫設(shè)定采用程序升溫：100 ℃維持 1 min，然后分別以 20 ℃/min升溫至160 ℃維持2 min，再以80 ℃/min升溫至 240 ℃維持5 min。進(jìn)樣器溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度為300 ℃。采用外標(biāo)法測(cè)定酯的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.5 減壓蒸餾

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，設(shè)定壓力為60 mmHg，油浴溫度100 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，蒸餾20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響

脂肪酶的催化活性和催化特異性與溶劑的性質(zhì)有關(guān)，通常有機(jī)溶劑的log P越大，脂肪酶的合成活性和穩(wěn)定性越高。當(dāng)溶劑log P＜2，溶劑極性較強(qiáng)，易奪取酶分子的必需水，從而影響酶的分子構(gòu)象，造成酶的失活[9]。

不同log P值的有機(jī)溶劑體系對(duì)酵母表面展示脂肪酶合成DIOA的影響見(jiàn)表1。結(jié)果表明，當(dāng)溶劑log P在3.5～5.1這個(gè)范圍內(nèi)時(shí)，DIOA的產(chǎn)率較高。綜合考慮溶劑的毒性及后續(xù)產(chǎn)品純化難度，選擇正庚烷為合成DIOA的溶劑。

2.2 醇酸摩爾比對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響

適當(dāng)提高異辛醇的添加量，有利于反應(yīng)平衡向生成DIOA的方向移動(dòng)。酸醇摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響如圖1所示，可知醇酸摩爾比為3.5∶1時(shí)，酵母表面展示脂肪酶合成DIOA的產(chǎn)率達(dá)到最高，酸醇摩爾比繼續(xù)提高，DIOA產(chǎn)率基本不變，但將提高生產(chǎn)成本和產(chǎn)物分離的難度。因此，異辛醇和己二酸的最優(yōu)摩爾比為3.5∶1。

表1 溶劑對(duì)DIOA產(chǎn)率的影響Table 1 Effect of different organic solvents on yield of DIOA

圖1 底物醇酸摩爾比對(duì)DIOA產(chǎn)率的影響Fig. 1 Effect of the initial mole ratio of iso-octyl alcohol to adipic acid on yield of DIOA. Reaction conditions:adipic acid 0.2 mol/L, 0.3 g displayed lipases, 0.6 g molecular sieve, 55 ℃.

2.3 底物濃度對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響

底物濃度對(duì)酯化反應(yīng)的影響由圖2所示，DIOA產(chǎn)率先隨著底物濃度的增加而增大，當(dāng)己二酸濃度增加到0.2 mol/L時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最大值，己二酸濃度繼續(xù)增加，產(chǎn)率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此該反應(yīng)的最優(yōu)己二酸濃度為0.2 mol/L。

2.4 酶量對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響

對(duì)于酶促反應(yīng)，提高酶的添加量，可使酶與底物接觸的機(jī)率增加，提高催化速度。但當(dāng)酵母表面展示脂肪酶的添加量過(guò)大時(shí)，容易造成細(xì)胞聚集，阻礙底物與酶活性位點(diǎn)的接觸[10]。從圖3可知，以畢赤酵母展示脂肪酶作為催化劑催化合成DIOA，其最優(yōu)添加量為0.4 g。

圖2 底物濃度對(duì)DIOA產(chǎn)率的影響Fig. 2 Effect of different adipic acid concentration on yield of DIOA. Reaction conditions: molar ratio of iso-octyl alcohol to adipic acid fixed to 3.5:1, 0.3 g displayed lipases,0.6 g molecular sieve, 55℃.

圖3 酵母表面展示脂肪酶濃度對(duì)DIOA產(chǎn)率的影響Fig. 3 Effect of the concentration of lipase on yield of DIOA. Reaction conditions: adipic acid 0.2 mol/L, molar ratio of iso-octyl alcohol to adipic acid fixed to 3.5: 1, 0.6 g molecular sieve, 55 ℃.

2.5 水活度對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響

微量的水分在維持酶結(jié)構(gòu)和構(gòu)象方面起著重要的作用?？墒姑阜肿佑凶銐虻摹叭嵝浴?，處于催化作用所必需的構(gòu)象狀態(tài)[11]。

由表2可知，經(jīng)MgCl2飽和溶液 (aw=0.33) 處理后的酵母表面展示脂肪酶合成 DIOA的產(chǎn)率最高，可能是由于該水活度條件下，酶分子處于催化作用所必需的最佳構(gòu)象。而水活度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚集影響傳質(zhì)。

2.6 分子篩對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響

水是酯化反應(yīng)中的副產(chǎn)物，反應(yīng)體系中水的積累不利于反應(yīng)向合成DIOA的方向進(jìn)行。因此，應(yīng)將多余的水從反應(yīng)體系中除去。本研究采用分子篩作為脫水劑，其成本低且易于分離和回收。分子篩添加量對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響如圖4所示，則該反應(yīng)最優(yōu)的分子篩添加量為0.8 g。

2.7 反應(yīng)溫度對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響

溫度是酶催化反應(yīng)的重要影響因素，可以影響酶的活性、穩(wěn)定性以及反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)[12]。在不同溫度下進(jìn)行酯化反應(yīng)，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)反應(yīng)溫度由50 ℃升高到70 ℃，反應(yīng)初速度也隨之提高，可能是較高的溫度有利于分子擴(kuò)散。反應(yīng)48 h時(shí)，DIOA的產(chǎn)率隨著溫度的升高而增加，55 ℃時(shí)達(dá)到最高產(chǎn)率85.0%，當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃，DIOA的產(chǎn)率開(kāi)始下降，可能是由于較高的溫度造成了酶的部分失活[8]。因此反應(yīng)最佳溫度為55 ℃。

表2 酵母表面展示脂肪酶的水活度對(duì)DIOA產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of different initial water activities of displayed lipases on yield of DIOA

圖4 分子篩添加量對(duì)DIOA產(chǎn)率的影響Fig. 4 Effect of the concentration of molecular sieve on yield of DIOA. Reaction conditions: adipic acid 0.2 mol/L,molar ratio of adipic acid to iso-octyl alcohol fixed to 1:3.5,0.4 g displayed lipases, 55 ℃.

圖5 溫度對(duì)己二酸二異辛酯產(chǎn)率的影響Fig. 5 Effect of temperature on yield of DIOA. Reaction conditions: adipic acid 0.2 mol/L, molar ratio of iso-octyl alcohol to adipic acid fixed to 3.5:1, displayed lipases 0.4 g(аw=0.33), 0.8 g molecular sieve.

2.8 反應(yīng)的初步放大與產(chǎn)品分離

采用以上各因素優(yōu)化條件，在攪拌反應(yīng)裝置中，將反應(yīng)體系放大到 200 mL，對(duì)規(guī)模制備進(jìn)行初步探索。結(jié)果表明，表面展示脂肪酶的酵母細(xì)胞可高效催化合成DIOA，其產(chǎn)率可達(dá)97.8%。經(jīng)減壓蒸餾提純產(chǎn)品，己二酸收率達(dá)91.6%，產(chǎn)品己二酸二異辛酯純度達(dá)98.2%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)幾個(gè)影響酯化反應(yīng)因素的考察，得出酵母表面展示脂肪酶合成DIOA的最佳工藝條件。在10 mL反應(yīng)體系中，以正庚烷為溶劑，反應(yīng)初始水活度為 0.33，己二酸濃度為 0.2 mol/L，底物醇酸摩爾比為3.5:1，添加0.8 g分子篩及0.4 g酵母表面展示脂肪酶，55 ℃反應(yīng)48 h后，DIOA產(chǎn)率可達(dá)85.0%。將反應(yīng)放大到 200 mL，DIOA產(chǎn)率可達(dá)97.8%。經(jīng)減壓蒸餾后，DIOA純度為98.2%。

采用畢赤酵母表面展示脂肪酶作為催化劑，可以較好地合成DIOA，且后期產(chǎn)物分離難度低；反應(yīng)條件溫和，不僅避免了對(duì)反應(yīng)設(shè)備的腐蝕，更節(jié)省了大量的設(shè)備維護(hù)和運(yùn)行費(fèi)用。采用優(yōu)化后的工藝條件，在攪拌反應(yīng)裝置中，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)體系放大。表明該表面展示脂肪酶具有用于酶法合成高質(zhì)量的綠色潤(rùn)滑油生產(chǎn)的潛力。

[1]Kolwzan B, Gryglewicz S. Synthesis and biodegradability of some adipic and sebacic esters. J Synthetic Lubric, 2003, 20:99?107.

[2]Tan TW, Chen BQ. Lipase fromCandidasp. 99-125 and its application in synthesis of chemicals. CIESC J, 2010, 61(7):1687?1692 (in Chinese).

譚天偉, 陳必強(qiáng).Candidasp. 99-125脂肪酶及其在化學(xué)品合成中的應(yīng)用. 化工學(xué)報(bào), 2010, 61(7): 1687?1692.

[3]Chaibakhsh N, Rahman A, Vahabzadeh F, et al.Optimization of operational conditions for adipate ester synthesis in a stirred tank reactor. Biotechnol Bioproc E,2010, 15(5): 846?853.

[4]T Tanino, T Ohno, T Aoki, et al. Development of yeast cells displayingCandida antarcticalipase B and their application to ester synthesis reaction. Appl Microbiol Biotechnol, 2007,75: 1319?1325.

[5]Shiraga S, Kawakami M, Ishiguro M, et al. Enhanced reactivity ofRhizopus oryzaelipase displayed on yeast cell surfaces in organic solvents: potential as a whole-cell biocatalyst in organic solvents. Appl Environ Microbiol,2005, 71(8): 4335?4338.

[6]Jin Z, Lin Y, Huang DF. Synthesis of flavor esters catalyzed by CALB-displayingPichia pastoriswhole-cells in non-aqueous phase. Chin J Biotech, 2009, 25(12):1927?1932 (in Chinese).

金子, 林影, 黃登峰, 等. 展示南極假絲酵母脂肪酶 B的畢赤酵母全細(xì)胞催化合成短鏈芳香酯. 生物工程學(xué)報(bào),2009, 25(12): 1927?1932.

[7]Jin Z, Han SY, Zhang L, et al. Combined utilization of lipase-displayingPichia pastoriswhole-cell biocatalysts to improve biodiesel production in co-solvent media.Bioresource Technol, 2013, 130: 102?109.

[8]Zheng SP, Ren CQ, Han SY, et al. Synthesis of glucose laurate monoester catalyzed byCandida antarcticalipase B-displayingPichia pastoriswhole-cells. Chin J Biotech,2009, 25(12): 1933?1939 (in Chinese).

鄭穗平, 任昌瓊, 韓雙艷, 等. 畢赤酵母表面展示南極假絲酵母脂肪酶B全細(xì)胞催化合成葡萄糖月桂酸酯. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(12): 1933?1939.

[9]Laane C, Boeren S, Vos K, Veeger C. Rules for optimization of biocatalyst is in organic solvents. Biotechnol Bioeng,1987, 30(1): 81?87.

[10]Jin Z, Ntwali J, Han SY, et al. Production of fl avor esters catalyzed by CALB-displayingPichia pastoriswhole-cells in a batch reactor. J Biotechnol, 2012,159 (1/2): 108?114.

[11]Hirofuml H, Katsuhiko H, Takao Y. Lipase-catalyzed transesterification in organic solvent: effects of water and solvent, thermal stability and some applications. J Biotechnol, 1990, 14: 157?167.

[12]Han SY, Pan ZY, Huang DF, et al. Highly ef fi cient synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by CALB-displayingSaccharomyces cerevisiaewhole cells in non-aqueous phase.J Mol Catal B: Enzym, 2009, 59(1/3): 168?172.