任玉瑩，陳丹，郭玉爭，史洪娜，劉娟，班靖洋，劉亞寧，吳曉芳，王維龍，程海，李鼎鋒，劉勇，王立良

北京安百勝生物科技有限公司，北京 100176

視黃醇類 (Retinoids) 是維生素 A(VitaminsA，vitA) 在體內(nèi)各種代謝物的統(tǒng)稱，主要包括視黃醇 (Retinol)、視黃醛 (Retinene)和視黃酸 (Retinoic acid，RA)，它們是一類疏水性分子，廣泛分布于細胞內(nèi)、外環(huán)境中[1]。視黃醇結(jié)合蛋白4 (Retinal binding protein4，RBP4) 是一種分泌型的運載蛋白，屬于疏水性的小分子結(jié)合蛋白家族，分子量約21 kDa，含有201個氨基酸殘基和 3個二硫鍵[2-3]，正常生理情況下主要在肝臟中合成，釋放入血后與視黃醇 (ROH) (維生素 A)、甲狀腺素運載蛋白 (TTR) 以 1∶1∶1的比例形成三元復(fù)合物，是體內(nèi)運送視黃醇至其特定靶組織的運載蛋白[4]。當 RBP4與細胞表面的RBP4受體結(jié)合后，視黃醇進入細胞內(nèi)，復(fù)合物解體，游離的 RBP從腎小球濾出，其中絕大部分被近端腎小管上皮細胞重吸收并被分解，供組織利用，僅有少量從尿中排出[5]。

目前，臨床上用于腎功能損傷早期診斷的尿小分子蛋白主要是 β2微球蛋白和 RBP4。β2微球蛋白在pH＜5.5時很不穩(wěn)定，易降解，取尿液標本后應(yīng)立即調(diào)pH至中性。而且β2微球蛋白在尿液中的半衰期較短：pH 4.0、4 ℃放置4 h后有70%的降解，而RBP4在相同條件下僅降解5%[6]。因此，RBP4相對于 β2微球蛋白在腎功能損傷診斷中更穩(wěn)定、更可靠。

近年來大量研究報道，血清和尿液中 RBP4是一個較敏感的指標，且隨著病程發(fā)展在反映早期腎損害時優(yōu)于 β2微球蛋白和尿微量白蛋白[7-9]，在糖尿病、腎病早期，尿RBP4排泄增加先于微白蛋白尿出現(xiàn)，被認為是反映早期腎損害的標志[10]。

原核表達系統(tǒng)表達蛋白通常作為獲得目的蛋白的首選方案，其表達量高、周期短、成品低，但絕大多數(shù)重組蛋白都以包涵體形式存在且沒有活性或者活性很低，其蛋白構(gòu)象通常與天然蛋白差異很大，這些是研究人員考慮的主要問題。本實驗室曾用E. coli系統(tǒng)表達人RBP4與其他報道一致，重組蛋白全部為包涵體，且復(fù)性困難活性低下。因此本文選用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)制備重組人 RBP4，獲得較高的表達量，并制備高質(zhì)量的抗體，為后續(xù)的產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)及實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌種和質(zhì)粒

Sf9昆蟲細胞，大腸桿菌TOP10、DH10Bac，pFastBac-dual 質(zhì)粒 (簡稱 pFBd)。

1.2 主要試劑和儀器

PyrobestTaq、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(TaKaRa)；DNA凝膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒 (OMEGA公司)；BAC/PAC試劑盒(Sigma 公司)；Grace’s Insect Medium (Gibco 公司)；GPM-115培養(yǎng)基 (金普諾安公司)；胎牛血清 (縮寫：FBS) (Gibco 公司)；L-Glutamine (中文名稱：谷氨酰胺，縮寫L-Gln) (Hyclone公司)；cellfectin reagent (Invitrogen 公司)；DMSO(Sigma公司)；山羊抗兔 IgG/辣根酶標記 (中杉金橋)；人源RBP4 (購自桂林英美特公司)；抗人RBP4兔多抗及大腸桿菌重組RBP4 (E-RBP4) 為實驗室自制。Ⅱ

1.3 基因來源

桿狀病毒密碼子優(yōu)化的bRBP4基因由本實驗室保存。

1.4 RBP4重組bacmid的構(gòu)建

1.4.1 信號肽與目的基因連接

pMD18-T-bRBP4 (實驗室保存) PCR擴增bRBP4基因，(引物：bRBP4-for，bRBP4-rev見表1) 獲得bRBP4基因。小量提取bacmid質(zhì)粒，以其為模板，PCR方法擴增SS64信號肽片段 (引物：SS64-for，SS64-rev)。然后以bRBP4、SS64PCR產(chǎn)物為模板，PCR方法擴增SS64-bRBP4基因 (引物：SS64-for，bRBP4-rev) 反應(yīng)條件：94 3 min℃ ；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 30 個循環(huán)；72 10 min℃ 。

1.4.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建

將 pFBd質(zhì)粒與SS64-bRBP4基因分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，并分別膠回收、連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10感受態(tài)細胞并涂布Amp-LB平板，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜。次日從平板上挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切(BamHⅠ+EcoRⅠ) 初步鑒定并送檢測序。

表1 構(gòu)建載體所用的引物Table 1 Primers used in vector construction

1.4.3 重組桿狀病毒構(gòu)建

將已鑒定的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFBd-SShRBP4和空白載體pFBd質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到DH10bac感受態(tài)細胞，37 ℃搖床培養(yǎng)4 h后涂三抗平板 (卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、X-gal、IPTG)，于37 ℃孵箱培養(yǎng)48 h。挑取陽性單菌落LB擴增，按BAC/PAC試劑盒方法提取bacmid質(zhì)粒。PCR擴增初步鑒定 (引物：PHsequ-F，M13-R) 反應(yīng)條件：94 3 min℃ ；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃90 s，共30個循環(huán)；72 10 min℃ 。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為rbacmid-RBP4，于?20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細胞培養(yǎng)

Sf9細胞于Grace培養(yǎng)基 (10%胎牛血清、1% GLN) 中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 27 ℃，細胞調(diào)整到對數(shù)生長期。

1.6 轉(zhuǎn)染表達

將 Sf9細胞接種到六孔板，接種量為9×105cells/孔，貼壁15～30 min備用，余下細胞擴增維持培養(yǎng)。各取 rbacmid-RBP4、rbacmid-pFBd 1～2 μg 按說明書 (Bac-to-Bac expression manual，Invitrogen) 分別進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染混合物加入細胞后，27 ℃孵育5 h，然后換液繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變。27 ℃培養(yǎng)72 h或出現(xiàn)明顯病變時結(jié)束培養(yǎng)。收集六孔板內(nèi)上清液作為P1代病毒進行轉(zhuǎn)接擴增，P1毒種取5 L接種到T25細胞瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯病變，無菌收集上清記為 P2代毒種。按試劑盒說明書進行滴定。

表達與鑒定：取 5瓶對數(shù)期 Sf9細胞 (T75培養(yǎng)瓶，密度70%)，將P2代毒種以MOI=1接種，繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯病變后逐日收集樣品，1000 r/min離心5 min，分離細胞及上清。用適量PBS重懸細胞，按1×105cells量通過SDS-PAGE和Western blotting進行檢測和鑒定。抗RBP4的兔多抗和HRP標記的羊抗兔IgG被用于Western blotting來檢測目的蛋白。

懸浮培養(yǎng)表達：將rbacmid-RBP4 P2代毒種接種到300 mL懸浮的培養(yǎng)細胞中，擴增培養(yǎng)，逐日取樣 (1 mL) 分離上清、細胞進行SDS-PAGE和Western blotting檢測和鑒定，其余按1.7操作。取表達樣品 (上清、細胞裂解液) 做2n(n=0，1，2) 倍比稀釋并進行 SDS-PAGE檢測，用標準品500 ng估測目的蛋白表達量。

1.7 純化

細胞培養(yǎng)上清經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，上樣于金屬 (Ni2+) 螯合瓊脂糖凝膠層析柱 (26 mm×20 cm)，流速8 mL/min。上樣結(jié)束后，用平衡液(50 mmol/L PB+0.5 mol/L NaCl+ 20 mmol/L咪唑，pH 7.4) 充分洗平層析柱，依次用不同咪唑濃度的緩沖液洗脫 (50 mmol/L PB+0.5 mol/L NaCl+100 mmol/L咪唑，50 mmol/L PB+0.5 mol/L NaCl+500 mmol/L咪唑)，收集A280吸收峰。SDS-PAGE檢測純化過程中RBP4的純度，凝膠成像掃描分析蛋白純度。

1.8 多克隆抗體的制備

選擇2月齡健康新西蘭大白兔制備多克隆抗體，抗原為桿狀病毒系統(tǒng)表達并純化的RBP4蛋白 (I-RBP4)，同時將原核表達系統(tǒng)獲得的同種蛋白 (E-RBP4，實驗室保存)、購進的人尿液提純的RBP4蛋白 (H-RBP4) 進行免疫，對比免疫效果，每個實驗組5只兔。

初免用抗原0.25 mg/只 (0.25 mL) 與等體積弗氏完全佐劑混合，乳化1 h以混合物滴到液面不擴散為乳化完全，免疫時脊柱兩側(cè)皮下多點注射0.05 mL/點。并于第2周、4周用不完全佐劑加強免疫，第6周頸動脈取血，分離抗血清檢測待用。

1.9 抗體效價及特異性測定

天然的人RBP4 (0.4 μg/mL) 包板檢測血清效價，將血清樣品以 10?3、10?4、10?5三個稀釋度稀釋，100 μL/孔 37 ℃孵育 30 min后洗板 5次，加入山羊抗兔IgG/辣根酶標記 (1∶3 000稀釋) 100 μL/孔 37 ℃孵育 30 min后洗板 5次，室溫顯色 10 min后終止。Thermo酶標儀檢測450 nm及630 nm的吸光度值。

同時將 Sf9細胞的培養(yǎng)上清、Sf9細胞破碎液 (超聲破碎離心的上清液) 分別包板，檢測血清樣品，并確定其特異性。

1.10 RBP4抗原抗體親和力試驗

取80 nm微球8 mL活化30 min，pH 7.2 MES過柱，按 20∶3的量分別偶聯(lián)硫銨初純后抗體(E-RBP4 PcAb、I-RBP4 PcAb、H-RBP4 PcAb)(PcAb，polyclonal antibody 即多克隆抗體)，室溫混勻過夜，甘氨酸封閉1 h。用0.05% SDS洗滌微球3次，最后重懸于儲存液中備用。測定前微球超聲5 S：3 S，4次使其具有良好的分散度。將偶聯(lián)抗體配入R2試劑。

參照安徽大千視黃醇結(jié)合蛋白檢測試劑盒的檢測方法，順序加入S (S為安徽大千RBP4標準品)，R1試劑 (Tris 50 mmol/L+NaCl 1 mol/L+BSA 0.1% pH 7.2)，R2試劑 (偶聯(lián)抗體+表面活性劑+穩(wěn)定劑)，R2加入后迅速混勻，測定A546，5 min后再次測定。

2 結(jié)果

2.1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的鑒定

隨機挑選3～5個陽性克隆經(jīng)LB (100 μg/mL Amp) 過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒、經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 (圖1)，有一條800 bp左右的片段產(chǎn)生，表明RBP4基因已經(jīng)成功克隆至pFBd載體中，隨后的測序結(jié)果顯示目的基因RBP4序列與預(yù)期完全一致，命名為 pFBd-SShRBP4。

圖1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBd-SShRBP4的酶切鑒定Fig. 1 Identification of the recombinant pFBd-SShRBP4 by restriction endonulease digestion. M1:DNA marker DL2 000; M2: DNA marker DL15 000; 1:pFBd-SShRBP4 digested with BamH I and EcoR I.

2.2 重組RBP4-bacmid的鑒定

挑選 3～5個純白色陽性克隆經(jīng) LB (含50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四環(huán)素、7 μg/mL慶大霉素) 過夜培養(yǎng)并提取 bacmid DNA，以引物 (PHsequ-F、M13R) 進行 PCR進一步篩選鑒定，PCR產(chǎn)物的經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果如圖2所示，重組bacmid PCR產(chǎn)物在1 600 bp左右出現(xiàn)特異性條帶 (而陰性對照 rbacmid-pFBd在800 bp處擴出單一條帶，未附圖)，表明bacmid構(gòu)建成功，命名rbacmid-RBP4。

2.3 細胞轉(zhuǎn)染及鑒定

提取rbacmid-RBP4 DNA轉(zhuǎn)染單孔細胞，逐日觀察病變情況，結(jié)果見圖3，細胞生長停止，腫脹、變圓，折光性增強，細胞核呈充滿狀態(tài)。部分細胞逐漸壞死、脫落，與正常細胞形成明顯對比，表明轉(zhuǎn)染成功 (圖3)。

圖2 重組rbacmid-RBP4的PCR鑒定Fig. 2 Identification of the recombinant rbacmid-RBP4 by PCR. M1: DNA marker DL 15 000; M2: DNA marker DL1 kb; 1: PCR production from rbacmid-RBP4.

2.4 蛋白表達量測定

按實驗要求留取細胞懸液，離心，上清細胞分離，SDS-PAGE或Western blotting檢測如下。

2.4.1 方瓶胞內(nèi)表達

以rbacmid-RBP4 P2代毒種接種T75細胞，從細胞出現(xiàn)明顯病變起開始收集樣品，每天收集1瓶感染細胞，分離細胞、上清，分別電泳檢測。結(jié)果見圖4，在23 kDa處可看到清晰的特異性條帶，與預(yù)測蛋白的分子量大小一致，表明 RBP4蛋白在Sf9細胞中成功表達。

2.4.2 懸浮擴增培養(yǎng)

以rbacmid-RBP4 P2代毒種感染懸浮培養(yǎng)細胞，感染4 d后取1 mL細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，取10 L上清液加入等量緩沖液混勻，煮沸3 min，10 L點樣檢測目的蛋白分泌表達量。結(jié)果見圖 5，表明 RBP4在懸浮培養(yǎng)的 Sf9細胞中得到高效表達。經(jīng)與標準品對照計算表達水平不低于100 mg/L。

圖3 正常Sf9細胞與轉(zhuǎn)染Sf9細胞的形態(tài)對比 (400×)Fig. 3 Morphological comparison of the normal and transfected Sf9 cells (400×). (A) Normal Sf9 cells. (B)Transfected Sf9 cells.

圖4 Western blotting鑒定RBP4在Sf9細胞內(nèi)的表達Fig. 4 Western blotting analysis of recombinant RBP4 protein in Sf9 cells. M: protein marker; 1?4: infected cells at 3rd/4th/5th/6th day post-infection; 5: RBP4 positive control.

2.5 目標蛋白的純化

目標蛋白經(jīng)金屬 (Ni2+) 螯合層析柱純化，產(chǎn)物SDS-PAGE分析，在分子量約23 kDa可見單一條帶 (圖 6)。純化后 I-RBP4含量為36.5 mg/L，收獲率為37%。

2.6 抗體制備

分別用桿狀病毒系統(tǒng)表達的 I-RBP4、原核表達的 E-RBP4、人源 H-RBP4抗原免疫新西蘭白兔，三針免疫獲得高效價抗血清，I-RBP4三免后 1：105稀釋度的血清OD450-630平均值為0.8850，而 E-RBP4三免后 1：105稀釋度的OD450-630平均值為0.1575低于臨界點，其抗體水平低于真核表達的，H-RBP4三免后1：105稀釋度的OD450-630平均值為 1.2604 (圖 7)。NC (兔陰性血清 1∶100稀釋)OD450-630平均值為 0.047，BC (空白對照)OD450-630平均值為0.009，血清無非特異性結(jié)合，實驗成立。從圖上可以看出，桿狀病毒系統(tǒng)表達的 I-RBP4抗原的免疫原性與人源H-RBP4抗原免疫原性接近，而遠好于原核表達的E-RBP4抗原的免疫原性，提示桿狀病毒系統(tǒng)表達的 I-RBP4蛋白具有類似人源 H-RBP4抗原的活性，而原核表達的 E-RBP4蛋白與人源H-RBP4抗原的活性相差很大?？寡逄禺愋詸z測結(jié)果表明：RBP4兔抗血清與 Sf9細胞 (培養(yǎng)基、細胞代謝物、細胞成分) 無交叉反應(yīng)，驗證其專屬性。

圖5 懸浮培養(yǎng)Sf9細胞表達RBP4的SDS-PAGE和Western blotting鑒定Fig. 5 SDS-PAGE and Western blotting analysis of recombinant RBP4 secreted by suspension cultured Sf9 cells. M:protein marker; 1: the supernatant from rbacmid-pFBd infected Sf9 cells at 72 h post-infection; 2: the supernatant from rbacmid-RBP4 infected Sf9 cells at 72 h post-infection.

圖6 Sf9細胞表達RBP4蛋白的純化鑒定Fig. 6 Purification of protein secreted by Sf9 cells. M:protein marker; 1: after purification.

2.7 抗原抗體親和力試驗

圖7 RBP4兔抗血清ELISA效價測定Fig. 7 ELISA analysis of RBP4 rabbit antiserum.

利用抗原 (RBP4標準品) 與特異性抗體(兔抗人視黃醇結(jié)合蛋白抗血清) 相結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，使反應(yīng)液產(chǎn)生混濁，其濁度即反應(yīng)樣品中視黃醇結(jié)合蛋白的濃度。

試驗中將不同來源的多克隆抗體與微球偶聯(lián)，放大信號更有效地檢測血清中低濃度的蛋白，紫外分光光度檢測確定抗原抗體的結(jié)合率。由表2可見，I-RBP4多抗與H-RBP4結(jié)合效果相近，遠高于E-RBP4多抗的效果。這提示本研究桿狀病毒系統(tǒng)表達生產(chǎn)的重組蛋白 I-RBP4具有和人源H-RBP4相似的生物學(xué)特性 (活性、高級結(jié)構(gòu))，而這些生物學(xué)特性為大腸桿菌生產(chǎn)的重組蛋白E-RBP4所不具備；這也驗證了桿狀病毒表達系統(tǒng)具有的優(yōu)越性之一，即其重組產(chǎn)品絕大多數(shù)具有很好的活性。

表2 抗原抗體親和力試驗Table 2 Antigen-antibody affinity test

3 討論

目前獲得RBP4蛋白的方法主要有兩個：其一，天然提純化。正常人體液中，RBP4含量甚微，血液中，RBP4濃度維持在25～70 mg/L；尿液中含量為0.7 mg/L[11]。在腎功能損傷病人中，尿液含量仍然較低，約1～3 mg/24 h尿，且尿液中的RBP4以多聚物形式存在，蛋白純化繁瑣，成本較高，得率較低[12]，不利于大量提取。其二，DNA重組技術(shù)制備。利用原核系統(tǒng)、真核系統(tǒng)表達目的蛋白。

原核系統(tǒng)表達目的產(chǎn)物主要為包涵體形式，多為錯誤折疊的RBP4和一些菌體蛋白以及核酸和一些脂類物質(zhì)，需要復(fù)性才能得到具有活性及實際的應(yīng)用價值，操作繁瑣、難度大、收率低、成本高，在結(jié)構(gòu)與功能上與天然蛋白有一定的差距；即使是在E. coli細胞內(nèi)直接表達的可溶性蛋白，在與特異性抗體的識別上也有明顯的差異。我們的動物免疫結(jié)果也證明了這點。

真核表達首選 Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)。此系統(tǒng)利用昆蟲細胞高效表達多種重組蛋白，在生物制品的研發(fā)與生產(chǎn)中有很大的應(yīng)用潛力[13-14]，并且有各種優(yōu)化方案可供選擇[15-17]。采用該系統(tǒng)重組病毒 DNA不含有親代病毒，免除空斑純化，節(jié)省成本提高效率。高滴度的病毒通過初步的轉(zhuǎn)染而獲得，這一特性將鑒定純化重組病毒的時間從4～6周縮減到7～9 d[18]，同時陽性克隆的轉(zhuǎn)化率從0.1%～1%提高到接近30%[19-20]。對脊椎動物而言意味著較好的生物安全性[21]。桿狀病毒系統(tǒng)還具有其他表達系統(tǒng)不具有的特性，如容納較大的外源 DNA (10 kb) 而不影響病毒的復(fù)制和裝配；適合表達細胞毒性蛋白[22]；可同時表達多種蛋白并完成病毒樣顆粒的構(gòu)建[23-24]；利用生物反應(yīng)器進行大規(guī)模的擴增培養(yǎng)[25]；可以在蟲體內(nèi)表達生產(chǎn)蛋白，大大節(jié)約成本[26]等。

實驗中利用EcoRⅠ和BamHⅠ兩個酶切位點將RBP4片段亞克隆到pFBd供體質(zhì)粒中，重組病毒的構(gòu)建在 DH10Bac感受態(tài)細胞中完成，通過pFBd供體質(zhì)粒上的mini-Tn7序列與bacmid上的 mini-attTn7序列進行轉(zhuǎn)座，獲得重組rbacmid-RBP4，并轉(zhuǎn)染到Sf9細胞而獲得重組的RBP4蛋白。

實驗初期，采用Grace (含F(xiàn)BS 10%) 培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)的Sf9細胞表達目的蛋白，自感染第3天起收集細胞和上清檢測，上清中表達量低未能檢出目的蛋白，而胞內(nèi)的表達從第3天起逐步加大，第5天達到最高。由上述摸索實驗得出如下結(jié)論：Grace培養(yǎng)基能夠支持目的蛋白的表達，但不是最佳的選擇。在此基礎(chǔ)上，逐步更換培養(yǎng)體系，用GPM-115 (含F(xiàn)BS 3%) 培養(yǎng)基逐步取代Grace培養(yǎng)基，實現(xiàn)細胞的懸浮培養(yǎng)，馴化后細胞從擴增速度、感染速度以及分泌表達上都有了一定的提高，當采用Grace培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)時，目的蛋白最大表達量出現(xiàn)在5～6 d，且僅為胞內(nèi)表達；而優(yōu)化條件后，細胞第3天即分泌大量目的蛋白并可持續(xù)到第5天，在無補料添加的條件下，表達量達100 mg/L以上。

真核細胞重組蛋白的優(yōu)點通過家兔免疫實驗得以證實。桿狀病毒系統(tǒng)表達的RBP4蛋白，其免疫原接近人源的RBP4，而優(yōu)于E. coli表達的 RBP4。這也從另一個角度證明了桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)的蛋白具有天然免疫原性。

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