何佳平，方彧聃 ，張帆，孫鳳強，王娟,2，張敬之 ,2

1 上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學附屬兒童醫(yī)院 上海交通大學醫(yī)學遺傳研究所，上海 200040

2 衛(wèi)生部醫(yī)學胚胎分子生物學重點實驗室暨上海市胚胎與生殖工程重點實驗室，上海 200040

轉錄通讀 (Read-through) 是指RNA聚合酶復合物在轉錄過程中遇到轉錄終止信號 (如AAUAAA signal) 時不能被正常終止，而是讀過終止信號繼續(xù)轉錄下游DNA序列的現(xiàn)象 (圖1)。它經(jīng)常發(fā)生在病毒或病毒載體基因的轉錄過程中。目前廣泛使用的第3代慢病毒載體經(jīng)過了自滅活改造 (刪除U3啟動子)，進一步降低其產(chǎn)生重組型活病毒的可能性。然而，自滅活改造同時亦刪除了 3端的轉錄終止上游序列 (USE) 從而提高了載體的轉錄通讀水平[1]。轉錄通讀現(xiàn)象的發(fā)生將有可能激活下游原本沉默的基因，這為慢病毒載體用以基因治療帶來了生物安全性方面的風險[2]。為了規(guī)避這種風險，研究者嘗試在病毒載體中插入隔離子來降低通讀率[3-7]。而建立一種快速有效的通讀率檢測方法，對于評估以上工作的效果，提高病毒載體的生物安全性具有重要意義。

目前測定轉錄通讀水平的方法主要是通過流式細胞儀等手段，定量轉錄通讀 mRNA所表達的蛋白產(chǎn)物。為了建立一種檢測轉錄通讀實際情況的方法，我們利用整合入染色體上的慢病毒載體原病毒 (Pro-viral vector) 的轉錄本中不存在5端U3，而只存在3端U3的原理，首先將總的病毒載體轉錄本以及其轉錄通讀轉錄本用相應的不同的下游特異引物進行分別反轉錄，然后使用特異針對3端的U3定量引物和探針，通過

qRT-PCR來對轉錄通讀率進行絕對定量。在此，我們的轉錄通讀率定義是：通讀mRNA的數(shù)量/(正常mRNA的數(shù)量+通讀mRNA的數(shù)量) ×100%。

本研究以攜帶野生型 LTR (wLTR) 和自滅活LTR (ΔLTR) 的兩種慢病毒載體作為研究對象進行通讀率的檢測，同時運用檢測通讀相對量的傳統(tǒng)方法加以驗證，以顯示該方法的有效性和準確性。

圖1 病毒載體的轉錄通讀現(xiàn)象Fig. 1 Phenomenon of transcriptional Read-through in viral vectors.

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌 TPO10宿主菌、pEGFP-N1載體(Invitrogen，美國) FUGW，NL4.3 (Addgene)，PyrobestTaqE，ExTaqE，T4 DNA 連接酶，ApaⅠ，XhoⅠ，MluⅠ，NheⅠ，dNTPs，RTase M-MLV，RNase Inhibitor (TaKaRa，日本)，Pac(New ⅠEngland Biolabs，NEB，美國) lipofectimin2 000，Trizol (Invitrogen公司)，引物合成 (Generay公司，上海)，定量引物及MGB探針合成 (GeneCore公司，上海)。

1.2 方法

1.2.1 載體構建

用 PCR方法擴出 HIV-1病毒株 NL4.3的3野生型 wLTR，擴增引物為 wLTR-XhoⅠ-F和wLTR-ApaⅠ-R。擴增產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和ApaⅠ雙酶切后，接入pEGFP-N1多克隆位點SalⅠ和ApaⅠ之間，構建出 pEGFP-N1-wLTR載體 (圖 2A)。用XhoⅠ和ApaⅠ雙酶切下慢病毒載體FUGW上的經(jīng)刪減 U3的 3LTR，接入 pEGFP-N1的SalⅠ和ApaⅠ之間，構建出 pEGFP-N1-ΔLTR 載體(圖 2B)。上述兩個載體主要用于檢測3LTR的通讀情況。

用分子克隆手段在FUGW的U5和flap之間插入一個單一的NheⅠ位點，得到FUGW (NheⅠ)載體。隨后在此基礎上，將3LTR接入MluⅠ和NheⅠ之間獲得 proFUGW-ΔLTR 載體 (圖 2D)；將兩個 3wLTR 分別接入MluⅠ、NheⅠ之間和XhoⅠ、ApaⅠ之間獲得 proFUGW-wLTR 載體(圖2C)。上述兩個載體可以用來模擬慢病毒整合入宿主基因組的情況，使檢測更接近于實際的通讀情況。

1.2.2 細胞轉染

將 pEGFP-N1、pEGFP-N1-LTR、pEGFP-N1-wLTR、proFUGW-ΔLTR 和 proFUGW-wLTR 5種載體，以等摩爾方式用lipofectimin 2 000轉染入293T細胞后，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h，經(jīng)0.25%胰酶消化細胞5～10 min后用含血清培養(yǎng)液終止反應。將細胞和培養(yǎng)液收集入1.5 mL的管中，離心棄上清后待用。

圖2 載體構建圖Fig. 2 Schematic diagram of the vectors. (A) pEGFP-N1-wLTR. (B) pEGFP-N1-ΔLTR. (C) proFUGW-wLTR.(D) proFUGW-ΔLTR.

1.2.3 qRT-PCR檢測轉錄通讀率

用 Trizol提取 pEGFP-N1-LTR、pEGFP-N1-wLTR、proFUGW-LTR和proFUGW-wLTR，4種載體轉染細胞后的總 RNA。待分光光度計測定濃度后，取相同量的 RNA，分別用引物 RP和LTR3進行反轉錄。這兩條引物分別設計在3LTR的R區(qū)域中PolyA信號 (AAUAAA) 位點的前后(圖 3)。取 cDNA產(chǎn)物作為模版，以 FP、RP作為引物，以 MGB-Probe作為探針，進行定量PCR。反轉錄及定量反應體系同參考文獻[8]，所用引物探針序列見表1。ABI 7 500實時定量PCR儀上進行反應，反應條件為：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；59 ℃時采集熒光，熒光檢測波長為FAM 510 nm。反應結束后通過定量 PCR儀的分析軟件對實驗結果進行分析，并計算出通讀率的變化：通讀率=通讀mRNA (以LTR3為引物進行逆轉錄獲得cDNA)/總 mRNA (以 PA-RP為引物進行逆轉錄獲得cDNA)。

1.2.4 熒光顯微鏡檢測

在已離心棄上清的轉染細胞沉淀中加入100 μL PBS，取少量單細胞懸液置于熒光顯微鏡下鏡檢，并檢測GFP陽性細胞數(shù)及熒光強度。

1.2.5 FACS檢測轉染細胞熒光強度

取50 μL細胞的單細胞懸液，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL以PBS為主的鞘液，經(jīng)流式細胞儀檢測，計數(shù)5×104個細胞，計算GFP平均熒光強度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel自帶統(tǒng)計軟件包，進行實驗組間單因素方差分析。

圖3 基于qRT-PCR檢測轉錄通讀率的方法Fig. 3 Flowchart of detecting Read-through rate by qRT-PCR.

表1 引物和探針序列Table 1 List of primers and probes

2 結果與分析

2.1 在 pEGFP-N1報告基因載體系統(tǒng)中檢測病毒元件LTR的轉錄通讀率

HIV載體的轉錄終止信號位于 3LTR的 R上。為了研究LTR的轉錄終止能力，我們把野生型 HIV的 LTR (wLTR) 和自滅活慢病毒載體的LTR (ΔLTR) 分別插入到表達載體pEGFP-N1中的多克隆位點 (MCS) 上 (圖 2A，B)，即位于CMV啟動子和報告基因EGFP之間。EGFP表達越強表明LTR的轉錄終止能力越弱，而轉錄通讀水平越高。

2.1.1 qRT-PCR檢測轉錄通讀率

帶有兩種類型LTR元件的表達載體pEGFPN1-ΔLTR和 pEGFP-N1-wLTR分別瞬時轉染293T細胞。轉染48 h后提取細胞的總RNA，經(jīng)DNaseⅠ(RNase free) 處理去除殘留的質粒DNA和基因組DNA。通過qRT-PCR的方法檢測LTR的轉錄通讀率。結果顯示 (圖4)，自滅活慢病毒載體的 ΔLTR轉錄通讀率達到了 64%，而 HIV病毒野生型wLTR的轉錄通讀率較低，約為36%(n≥5，P＜0.01)。

圖4 qRT-PCR檢測pEGFP-N1-wLTR和pEGFPN1-ΔLTR的轉錄通讀率Fig. 4 Read-through rate of pEGFP-N1-wLTR and pEGFP-N1-ΔLTR detected by qRT-PCR.

2.1.2 通過檢測 EGFP的蛋白表達來驗證轉錄通讀的效率。

基于 qRT-PCR檢測轉錄通讀的方法檢測到的是通讀率的絕對數(shù)值。為了驗證該方法的準確性，我們在蛋白水平檢測了轉錄通讀的相對水平。表達載體 pEGFP-N1-ΔLTR 和 pEGFP-N1-wLTR分別瞬時轉染 293T細胞 (以轉染pEGFP-N1的293T作為陰性對照)。轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達水平。熒光圖片顯示 (圖 5) 插入 ΔLTR和 wLTR以后 EGFP陽性細胞數(shù)與陰性對照組相比均有顯著的減少。這說明這兩種LTR均有轉錄終止能力。但是，插入wLTR組比插入ΔLTR組的陽性細胞數(shù)要少的多，這說明ΔLTR比wLTR的轉錄通讀率要高。上述細胞經(jīng)胰酶消化，進行 FACS檢測。FACS結果 (圖 6) 與熒光鏡檢的結果相一致，插入wLTR組的平均熒光強度比插入ΔLTR組弱55%左右 (n≥5，P＜0.01)。也就是說 ΔLTR的轉錄通讀率高于wLTR，這一結果與qRT-PCR的結果相一致。因此，熒光顯微鏡鏡檢結果和FACS結果均驗證了我們建立的基于 qRT-PCR檢測轉錄通讀率方法的準確性。

2.2 模擬病毒載體整合入染色質后的轉錄通讀率檢測

病毒載體顆粒感染細胞后，釋放出mRNA，經(jīng)反轉錄形成兩端帶有兩個相同 LTR的雙鏈DNA，并且整合入染色體中。整合入染色體中的病毒DNA被稱為原病毒。檢測病毒載體整合入細胞基因組中的轉錄通讀率比檢測單個 LTR的通讀率更能反映其在染色體上的實際情況。由于慢病毒載體的隨機整合特性，載體整合位點附近的染色體環(huán)境將極大地影響轉錄通讀率。為了規(guī)避染色體環(huán)境因素的影響，我們用質粒來模擬病毒載體整合入基因組的序列，進行轉錄通讀率的檢測。

圖5 pEGFP-N1、pEGFP-N1-wLTR和pEGFP-N1-ΔLTR轉染293T的熒光顯微鏡鏡檢圖 (400×)Fig. 5 Microscopic observation of 293T cells transfected with pEGFP-N1, pEGFP-N1-wLTR and pEGFP-N1-ΔLTR(400×). (A) 293T cells transfected with pEGFP-N1. (B) 293T cells transfected with pEGFP-N1-ΔLTR. (C) 293T cells transfected with pEGFP-N1-wLTR. A1, B1, C1: microscopic photos under the natural light; A2, B2, C2: microscopic photos under the natural light plus fluorescence; A3, B3, C3: microscopic photos under the fluorescence.

圖6 pEGFP-N1、pEGFP-N1-wLTR和pEGFP-N1-ΔLTR的平均熒光強度Fig. 6 Mean fluorescent intensity of pEGFP-N1,pEGFP-N1-wLTR and pEGFP-N1-ΔLTR by FACS.

原病毒模擬載體 proFUGW-ΔLTR 和proFUGW-wLTR (圖 2C，D) 分別轉染 293T細胞。轉染48 h后，通過基于qRT-PCR的方法檢測轉錄通讀率。檢測結果顯示 (圖7)，自滅活慢病毒載體的轉錄通讀率為 59%左右，而攜帶wLTR的慢病毒載體轉錄通讀率約為22% (n≥9，P＜0.01)。

3 討論

慢病毒載體是研究者們對人類 1型艾滋病毒 (Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) 進行拆分，改造而形成的一種高效基因介導載體[9-11]。

圖7 qRT-PCR檢測proFUGW-wLTR和proEGFPN1-ΔLTR的轉錄通讀率Fig. 7 Read-through rate of proFUGW-wLTR and proEGFP-N1-ΔLTR detected by qRT-PCR.

在HIV-1的LTR (即wLTR) 中已知的轉錄終止調控序列包括：位于R區(qū)的多聚腺苷酸化信號AAUAAA元件，AAUAAA上游 59～76 nt、77～94 nt、141～176 nt間的 3個 USEs[12-14]，位于U5富含 GC的 DSE[15-16]和位于 R和 U5接界的Poly (A) 位點[17]。慢病毒載體自滅活改造時，在刪除U3啟動子的同時刪除了3'端的轉錄終止的一系列上游序列[18]。經(jīng)刪減后的LTR (即ΔLTR)與wLTR相比其通讀率有顯著的提高[1]。

而轉錄通讀的危害在臨床基因治療中已有體現(xiàn)。在運用 γ-逆轉錄病毒進行臨床基因治療的過程中，一些接受治療的病人卻相繼得了白血病[19-21]。

與γ-逆轉錄病毒載體類似，在使用自滅活慢病毒載體進行基因治療的過程中，同樣存在著因轉錄通讀而造成激活下游基因的風險。正因如此，在用慢病毒載體治療-地中海貧血的過程中，科學家們在△U3中插入了兩個拷貝的雞隔離 子 (The chicken β-globin 5′ DNaseⅠhypersensitive site 4 insulator，CHS4) 以減少轉錄通讀率[22]。所以，在改造載體前后，需要有一種能夠準確檢測及評估通讀率的方法。文中我們描述了用 qRT-PCR確定其轉錄通讀的實際值的方法。在此過程中，我們使用了兩套不同的特異性引物對慢病毒載體總轉錄本和通讀轉錄本分別進行了反轉錄; 在此基礎上，采用了同一套定量引物和探針分別對它們進行定量，從而避免了在擴增過程中兩組cDNA的擴增效率的差異，保證了檢測結果的準確性。

Yang等2007年報道了一種檢測單一LTR轉錄通讀率的較為復雜的方法，他們使用了 LacZ報告基因表達后染色來直觀地顯示通讀率[1]。他們在蛋白活性上的檢測數(shù)據(jù)與我們在 mRNA水平上模擬慢病毒載體在染色體上的情況相比盡管趨勢相同，但數(shù)值小了很多，有可能是由于額外的翻譯因素所造成的，因此，與他們的方法相比，我們的方法有可能更加準確地體現(xiàn)了轉錄通讀的實際情況。通過對3'LTR和3'wLTR分別在轉錄和翻譯水平上的分析，我們認為，我們所建立的方法能夠有效和真實地體現(xiàn)慢病毒載體的轉錄通讀率，為慢病毒載體改進工作提供了技術支持。

致謝：衷心感謝曾溢滔院士和任兆瑞教授對本文的悉心指導。

[1]Yang Q, Lucas A, Son S, et al. Overlapping enhancer/promoter and transcriptional termination signals in the lentiviral long terminal repeat.Retrovirology, 2007, 4(4):1?8

[2]Zaiss A, Son S, Chang L. RNA 3’readthrough of oncoretrovirus and lentivirus: implications for vector safety and efficacy. J Virol, 2002, 76(14):7209?7219.

[3]Ramezani A, Hawley TS, Hawley RG..Combinatorial incorporation of enhancer blocking components of the chicken β-globin 5′HS4 and human T-cell receptor α/δBEAD-1 insulators in self-inactivating retroviral vectors reduces their genotoxic potential. Stem Cells, 2008, 26(12):3257?3266.

[4]Chang L, Ding X, George S, et al. Genomic and functional assays demonstrate reduced gammaretroviral vector genotoxicity associated with use of the cHS4 chromatin insulator. Mol Ther, 2009, 17(4): 717?724.

[5]Paritha I, Tomoyasu H, Fabrizia U, et al. Genotoxic potential of lineage-specific lentivirus vectors carrying the β-globin locus control region. Mol Ther, 2009, 17(11): 1929?1937.

[6]Ramezani A, Hawley TS, Hawley RG. Reducing the genotoxic potential of retroviral vectors.Methods Mol Biol, 2008, 434: 183?203.

[7]Hideki H, Motoko Y, Huifen Z, et al. Optimized lentiviral vector design improves titer and transgene expression of vectors containing the chicken β-globin locus HS4 insulator element. Mol Ther, 2009, 17(4): 667?674.

[8]Ma H，F(xiàn)ang YD，Zhang JZ. A novel method for the determination of recombinant lentiviral titer and infectivity by qRT-PCR. Life Sci Res, 2009, 13(5):394?398 (in Chinese).

馬海燕, 方彧聃, 張敬之. 應用熒光實時定量PCR方法檢測重組慢病毒滴度及感染率. 生命科學研究, 2009, 13(5): 394?398.

[9]Poznansky M, Lever A, Bergeron L, et al. Gene transfer into human lymphocytes by a defective human immunodeficiency virus type 1 vector. J Virol, 1991, 65(1): 532?536.

[10]Naldini L, Blomer U, Gallay P, et al.In vivogene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science, 1996,272(5259): 263?265.

[11]Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, et al. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene deliveryin vivo. Nat Biotechnol, 1997, 15(9):871?875.

[12]Valsamakis A, Zeichner S, Carswell S, et al. The human immunodeficiency virus type 1 polyadenylylation signal: A 3' long terminal repeat element upstream of the AAUAAA necessary for efficient polyadenylylation. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(6): 2108?2112.

[13]Gregory M, Elizabeth S, Joyce O, et al. Activation of HIV-1 pre-mRNA 3' processingin vitrorequires both an upstream element and TAR. EMBO J,1992, 11(12): 4419?4428.

[14]Valsamakis A, Schek N, Alwine JC, et al. Elements upstream of the AAUAAA within the human immunodeficiency virus polyadenylation signal are required for efficient polyadenylationin vitro. Mol Cel Boil, 1992, 12(9): 3699?3705.

[15]B?hnlein S, Hauber J, Cullen BR. Identification of a U5-specific sequence required for efficient polyadenylation within the human immunodeficiency virus long terminal repeat. J Virol, 1989, 63(1): 421?424.

[16]Brown PH, Tiley LS, Cullen BR, et al. Effect of RNA secondary structure on polyadenylation site selection. Genes Dev, 1991, 5(7): 1277?1284.

[17]Dezazzo JD, Kilpatrick JE, Imperiale MJ, et al.Involvement of long terminal repeat U3 sequences overlapping the transcription control region in human immunodeficiency virus type 1 mRNA 3'end formation. Mol Cel Boil, 1991, 11(3):1624?1630.

[18]Zufferey R, Dull T, Ronald J, et al.Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficientin vivogene delivery. J Virol, 1998,72(12): 9873?9880.

[19]Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1.Science, 2003, 302(17): 415?419.

[20]Hacein-Bey-Abina S, Garrigue A, Wang GP, et al.Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest, 2008, 118(9): 3132?3142.

[21]Hacein-Bey-Abina S, Hauer J, Lim A, et al.Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N Engl J Med, 2010,363(4): 355?364.

[22]Ramezani A, Hawley TS, Hawley RG. Performance and safety-enhanced lentiviral vectors containing the human interferon-β caffold attachment region and the chicken-globin insulator. Blood, 2003,101(12): 4717?4724.