周海燕,馬軍,楊雪麗,龔笑海,李秋萍,金堅
江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,江蘇 無錫 214122
聚 ADP核糖聚合酶 (Poly ADP-ribose polymerase,PARP)[1]是一種參與DNA修復(fù)的核酶,能夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 為底物,將聚腺苷二磷酸核糖基轉(zhuǎn)移到受體蛋白的谷氨酸殘基上,催化合成 PAR聚合物。但在該反應(yīng)過程中會消耗大量ATP和NAD+,導(dǎo)致細胞死亡。由于PARP的激活在缺血再灌注、糖尿病、炎癥和腫瘤[2]的病理過程中起著重要作用,這預(yù)示PARP抑制劑在治療這些疾病中方面有著良好的前景。特別是在腫瘤治療中,PARP已成為一個重要的新的治療靶點[3]。
PARP是一個蛋白超家族,包括 PARP1、PARP2、PARP3、Vault-PARP、TANK1、TANK2和TANK3等亞型[4],其中對PARP1的研究最為深入和廣泛。PARP1分子量為116 kDa,含有3個主要區(qū)域:N端為46 kDa的DNA結(jié)合區(qū)域,中間是一個22 kDa的自我修飾區(qū)域和C端是一個54 kDa的催化區(qū)域。當(dāng)PARP1的鋅指結(jié)構(gòu)檢測到DNA單鏈或雙鏈斷裂時,PARP1形成二聚體并催化NAD+合成煙酰胺和聚ADP核糖[5]。
聚ADP核糖聚合酶廣泛應(yīng)用于PARP1抑制劑的篩選、PARP1與其他DNA修復(fù)蛋白關(guān)系研究等。1986年,Burtscher等[6]首次在大腸桿菌中表達出有活性的PARP1,此后,一些研究學(xué)者紛紛發(fā)現(xiàn)酵母細胞[7]、CHO細胞[8]及其昆蟲細胞[9]都可以作為 PARP1的表達宿主,其中昆蟲細胞表達量較高[6-9],1 L大腸桿菌僅純化出 0.3 mg hPARP1[6],而僅僅100 mL的昆蟲細胞便可純化出其 10倍以上 hPARP[9]。目前,國內(nèi)尚未見成功表達純化hPARP1研究的報道。
本實驗室從分子構(gòu)建開始,利用 Bac-to-bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功地表達出高活性的hPARP1,并利用 hPARP1酶可以被 3-氨基苯甲酰胺特異性親和的特點純化出了高活性的hPARP1,為PARP1抑制劑的篩選奠定了基礎(chǔ)。
hPARP1基因購自 OriGene科技有限公司。質(zhì)粒 pFastBacTM1、大腸桿菌Escherichia coliDH10Bac、Escherichia coliDH5α和草地貪夜蛾卵巢細胞系 (Spodoptera frugiperda9,Sf9) 均由本實驗室保存。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 (Lipofection 2000 Reagent) 和 SF900ⅡSFM 昆蟲細胞培養(yǎng)基購自 GIBCO公司;瓊脂糖回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶SgfⅠ和MiuⅠ購自寶生物工程 (大連)有限公司;質(zhì)粒純化試劑盒和T4 DNA連接酶購自生物工程 (上海) 股份有限公司;ECH Sepharose 6B和 EDC購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司;3-氨基苯甲酰胺 (3AB) 購自阿拉丁公司;Anti-PARP1 (sc-74470) 多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology,Anti-mouse IgG-HRP二抗購自 Vector公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級。
用SgfⅠ/MiuⅠ雙酶切PCMVhPARP1,回收hPARP1片段,并克隆至 pFastBacTM1的相應(yīng)位點中,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliDH5α感受態(tài)細胞中。鑒定為陽性的重組子點接在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),采用質(zhì)粒純化試劑盒提取重組質(zhì)粒pFast-hPARP1,用SgfⅠ/MiuⅠ雙酶切鑒定,并送上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。取E. coliDH10Bac感受態(tài)細胞,加入1 ng的重組質(zhì)粒 pFast-hPARP1,42 ℃熱擊 45 s后,于 LB培養(yǎng)基37 ℃孵育4 h,涂布在含有抗性的平板上,并加入X-gal,將平板于37 ℃培養(yǎng)48 h,篩選白色菌落作為陽性質(zhì)粒Bacmid-hPARP1。提取的陽性質(zhì)??捎糜谙乱徊睫D(zhuǎn)染實驗。
采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒Bacmid-hPARP1轉(zhuǎn)染Sf9細胞,操作步驟按照產(chǎn)品說明書進行。每孔 8 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Sf9細胞4~6 h后更換SF900ⅡSFM,同時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,作為陰性對照。6 d后觀察細胞出現(xiàn)病變,收集細胞上清12 000 r/min離心5 min,收集上清并4 ℃避光保存,所獲得的細胞即為P1代。取P1代重組病毒,按照 1∶10稀釋后,感染處于對數(shù)生長期的Sf9細胞,27 ℃培養(yǎng)3 d,細胞出現(xiàn)明顯病變時收集上清,得到 P2代病毒。同樣方法再傳一代,篩選到高滴度的含有hPARP1基因的重組桿狀病毒。用 P3代高滴度的病毒感染細胞48 h、56 h、64 h和72 h后,分別收集病變的細胞。
收集病變的細胞,用PBS重懸后,超聲裂解細胞,12 000 r/min離心 10 min,上清進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜并用5%的脫脂奶粉封閉后,用鼠抗 hPARP1的一抗 4 ℃孵育過夜,經(jīng)TBST洗滌后,二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫孵育2 h,洗滌后顯色并觀察特異性條帶。
1.5.1 NAD+標(biāo)準曲線的測定
黑色96孔板中加入20 μL NAD,使其終濃度分別為 0.48、0.97、1.95、3.9、7.81、15.625、31.25、62.5、125和250 nmol/L,每個濃度設(shè)4個孔。然后加入 10 μL 的 PARP 稀釋緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L MgCl2,pH 8.0),加入10 μL的2 mol/L KOH和10 μL的20%苯乙酮,4 ℃反應(yīng)10 min;最后加入45 μL的88%甲酸,110 ℃反應(yīng)5 min,待板溫度降到常溫時,在激發(fā)波長 (360±15) nm,發(fā)射波長 (445±15) nm條件下[10]測熒光強度。
1.5.2 hPARP1活性的測定
在黑色96孔板中加入20 μL的125 nmol/L NAD+,10 μL不同含量的溶于 PARP緩沖液中hPARP1和DNA (終濃度為15 mg/L) 混合物。反應(yīng) 15 min后,加入 10 μL 2 mol/L KOH 和 10 μL 20%苯乙酮,4 ℃反應(yīng)10 min;最后加入45 μL 88%甲酸,110 ℃反應(yīng)5 min,待板溫度降到常溫時,在激發(fā)波長 (360±15) nm,發(fā)射波長(445±15) nm條件下測熒光強度,同時設(shè)置空白對照孔為 20 μL125 nmol/L NAD+,10 μL PARP緩沖液和DNA (終濃度為15 mg/L) 混合物,其hPARP1活性為0%[10-11]。
1.6.1 3-氨基苯甲酰胺 (3AB) 親和層析柱的合成
用0.5 mol/L NaCl洗滌25 mLECH Sepharose 6B,去除乙醇后,用0.1 mol/L NaOH將其pH調(diào)至 4.5~6.0之間。在 4 ℃條件下,在 ECH Sepharose 6B中緩慢加入 1 g的 EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride) 和 0.5 g 溶于 1 mL甲醇中的 3-氨基苯甲酰胺,搖動過夜,并保持其 pH為4.5~6.0。用 100 mmol/L乙酸鈉 (pH 4.0) 和0.5 mol/L NaCl終止交聯(lián),并用 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 和 0.5 mol/L NaCl洗滌填料[12]。
1.6.2 利用 3-氨基苯甲酰胺(3AB)親和層析柱純化hPARP1
12 000 r/min離心5 min,收集Sf9細胞,將其重懸于緩沖液 A (50 mmol/L葡萄糖,0.2%Tween 20,0.5 mmol/L EDTA 和 0.5 mmol/L PMSF),超聲破碎后12 000 r/min離心30 min,硫酸魚精蛋白 (終濃度1 mg/mL) 去除其DNA,上清液中緩慢加入硫酸銨,使硫酸銨的飽和度達到 70%后,4 ℃靜置 1 h。12 000 r/min離心20 min,用緩沖液 B (100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,14 mmol/Lβ-巰基乙醇,0.5 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L PMSF) 溶解沉淀。
在層析柱中裝20 mL ECHsepharose 6B-3AB親和填料,并用緩沖液B平衡后,以重力速度流速上樣。用含有 100 mmol/L、400 mmol/L和800 mmol/L NaCl不同濃度的緩沖液B除去樣品中未結(jié)合的蛋白,然后用洗脫液 (100 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,400 mmol/L NaCl,1 mmol/L 3-甲氧基苯甲酰胺,14 mmol/L β-巰基乙醇,0.5 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L PMSF) 進行洗脫,并收集樣品。
圖 1 重組質(zhì)粒 pFast-hPARP1雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 1 Identification of recombinant transfer plasmid by enzyme digestion. M: DNA marker; 1: recombinant transfer plasmid digested with Sgf Ⅰand MiuⅠ.
重組質(zhì)粒 pFast-hPARP1是通過將hPARP1基因插入到質(zhì)粒pFastBacTM1的SgfⅠ和MiuⅠ兩個酶切位點間來構(gòu)建的。獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)SgfⅠ和MiuⅠ雙酶切進行鑒定,酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析 (圖1)。通過雙酶切鑒定,理論預(yù)測目的片段約為3 045 bp。圖1中泳道2可以看出,質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)2條帶,有一條帶約在3 000 bp處出現(xiàn),可能對應(yīng)的是hPARP1基因片段,將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序,測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒上的hPARP1基因與報道的基因序列完全一致,表明hPARP1基因被正確克隆到質(zhì)粒pFastBacTM1上,可用于下一步的實驗中,將pFast-hPARP1導(dǎo)入E. coliDH10Bac感受態(tài)細胞,發(fā)生轉(zhuǎn)座后,挑取白色的陽性質(zhì)粒,為Bacmid-hPARP1。
提取重組質(zhì)粒 (Bacmid-hPARP1) 并轉(zhuǎn)染Sf9細胞,6 d后可見轉(zhuǎn)染Bacmid-hPARP1的細胞直徑增大,細胞核充滿整個細胞,細胞發(fā)生病變。將 P3代病毒接種到對數(shù)生長期的 Sf9細胞中,分別在48、56、64和72 h后收集病變細胞。超聲破碎并離心后,取上清將感染細胞和野生病毒感染的 Sf9細胞組分別進行 SDS-PAGE電泳(圖2),圖2中可在泳道2、3、4、5清晰地看見116 kDa處hPARP的條帶。并利用免疫印跡試驗(Western blotting) 對細胞內(nèi)的hPARP1酶進行結(jié)合特異性檢測 (圖3)。從圖3中可以看出,轉(zhuǎn)染pFast-hPARP1的昆蟲細胞可以與hPARP1抗體發(fā)生特異性反應(yīng),而野生病毒感染的Sf9細胞組與hPARP1抗體并無結(jié)合反應(yīng)。免疫印跡結(jié)果表明,Sf9昆蟲細胞成功表達hPARP1酶。
2.3.1 NAD+標(biāo)準曲線的確定
選擇一系列濃度的底物NAD+,按照上述方法測定熒光值,結(jié)果顯示 (圖4) 在1 nmol/L時候就可以檢測生成化合物的熒光,當(dāng)濃度達到250 nmol/L時仍然具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9984)。根據(jù)標(biāo)準曲線的測定,選擇熒光值大約一半時的底物濃度,125 nmol/L NAD+作為酶活測定的標(biāo)準。
圖2 SDS-PAGE檢測昆蟲細胞表達hPARP1Fig. 2 Identification of hPARP1expressed by Sf9 insect cell by Commassie blue staining. 1: Sf9 insect cell transfected with plasmid pFastBacTM1; 2: hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell after 48 h; 3:hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell after 56 h;4: hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell after 64 h; 5: hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell after 72 h; 6: protein marker.
圖3 Western blotting分析hPARP1抗體與hPARP1酶的特異性結(jié)合Fig. 3 Identification of hPARP1 expressed by Sf9 insect cell by Western blotting. 1: hPARP1 enzyme expressed in Sf9 insect cell identified by Western blotting;2:Sf9 insect cell transfected with plasmid pFastBacTM1.
圖4 NAD+標(biāo)準曲線Fig. 4 NAD+ calibration curve.
2.3.2 hPARP1活性的測定
hPARP1活性的測定是通過檢測其底物NAD+的量來間接測定hPARP1的活性,NAD+屬于N-烷基吡啶類化合物,其可以與酮類反應(yīng),在過量酸中加熱轉(zhuǎn)化為熒光分子,通過測定熒光值變化間接反應(yīng) hPARP1活性。根據(jù)標(biāo)準曲線,使用125 nmol/L NAD+作為酶活測定的底物,分別加入純化后的不同量的 hPARP1酶和相同 DNA,反應(yīng)15 min。結(jié)果可見圖5,隨著hPARP1量增加,熒光值逐漸降低,說明在相同時間內(nèi),隨著hPARP1酶濃度的增加,底物NAD+被消耗的越多,即剩余的NAD+越少,熒光值越小。
圖5 hPARP1的活性Fig. 5 Activity of purified hPARP1.
收集病變的細胞,超聲破碎并離心后,利用硫酸魚精蛋白去除 DNA。通過 70%硫酸銨沉淀,一方面富集 hPARP1酶和去除部分雜蛋白(圖6);另外一方面,通過硫酸銨沉淀使hPARP1酶的比活從 0.051 nmol/(min?μg) 提高到0.072 nmol/(min?μg) (表 1),純化倍數(shù)提高了 1.4倍,產(chǎn)率為91.5%。
由于 3-氨基苯甲酰胺是 PARP1的抑制劑,它可以與 PARP1的催化結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合,所以我們利用 PARP1的這一特點交聯(lián)合成了 3-氨基苯甲酰胺柱,并用它對hPARP1進行純化。首先,用不同濃度的鹽溶液梯度洗除雜質(zhì),然后用含有3-甲氧基苯甲酰胺的洗脫液進行洗脫,收集液用紫外監(jiān)測儀檢測。純化后的蛋白進行還原性SDS-PAGE分析 (圖6)。如圖6 所示,泳道2中可以清晰觀察到 116 kDa附近有一條很深的條帶,經(jīng)掃描分析,其純度大于90%。結(jié)果表明通過利用 hPARP1酶的親和層析柱可以實現(xiàn)hPARP1酶的分離純化,并獲得到較高純度的hPARP1酶蛋白,同時還可以大大提高 hPARP1酶的比活,達到1.988 nmol/(min?μg)。經(jīng)過親和純化后,hPARP1酶的純化倍數(shù)提高了38倍,并且產(chǎn)率仍維持在80%以上。
圖6 SDS-PAGE檢測hPARP1酶的純化Fig. 6 Commassie blue staining of the purified poly(ADP-ribose) polymerase1 from Sf9 lysate. M: protein marker; 1: 3-aminobenzamide affinity chromatography;2: ammonium sulfate precipitation; 3: cleared lysate.
表1 hPARP1純化活性Table 1 hPARP1 activity during the purification
近年來,由于 PARP1與炎癥、腫瘤、缺血再灌注等病理過程有著密切的聯(lián)系,PARP1已經(jīng)成為一個新的治療靶點。目前,PARP1抑制劑的篩選已經(jīng)成為抗腫瘤藥物的研究熱點[13-15],PARP1抑制劑 AZD2281[16],ABT-888[17]等已經(jīng)進入臨床試驗階段,但是由于其臨床用藥量比預(yù)期稍大,臨床試驗陷入了一定的困境[18],因此,純化出大量高活性的 hPARP1酶有利于我們對PARP1晶體結(jié)構(gòu)的探索,進而增加對PARP這個靶點的認識。同時,高活性及純度的聚 ADP核糖聚合酶在 PARP1抑制劑篩選中的應(yīng)用具有廣闊的前景。
由于E.coli中有PARP1的水解酶及其蛋白在原核表達系統(tǒng)中的折疊不同[9],E.coli中表達的有活性的hPARP1的表達量較低,因此我們采用桿狀病毒表達系統(tǒng)。昆蟲表達系統(tǒng)有諸多優(yōu)點,如能進行翻譯后修飾,酶的活性比較穩(wěn)定,產(chǎn)量高,適用性強等[19]。本研究將編碼hPARP1基因重組于桿狀病毒表達載體中,成功構(gòu)建了能夠表達 hPARP1酶的重組桿狀病毒。Western blotting表明該病毒表達的 hPARP1酶可被hPARP1單克隆抗體識別,表明該系統(tǒng)表達的hPARP1具有免疫原性;酶活測定實驗表明hPARP1有良好的生物活性。
hPARP1酶在體外極不穩(wěn)定,容易降解,其半衰期極短[20]。本研究僅僅利用一個親和層析柱將hPARP1純化,這為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能。純化后的hPARP1酶仍具有良好的生物活性,本研究一方面為 PARP1抑制劑的篩選創(chuàng)造了條件;另一方面,從100 mL的昆蟲細胞中即可純化得到3.2 mg的PARP1酶,表明通過桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn) PARP1酶可以獲得很高的產(chǎn)量,這為大規(guī)模生產(chǎn)hPARP1酶奠定了基礎(chǔ)。同時,大量生產(chǎn) hPARP1酶對我們進一步研究hPARP1的晶體結(jié)構(gòu),增加對 PARP1的認識提供了必要的條件。
[1]Jagtap P, Szabó C. Poly (ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. Nat Rev Drug Discov, 2005, 4(5): 421?440.
[2]Aguilar-Quesada R, Munoz-Gamez J, Martin-Oliva D, et al. Modulation of transcription by PARP-1:consequences in carcinogenesis and inflammation.Curr Med Chem, 2007(11), 14: 1179?1187.
[3]Bryant HE, Schultz N, Thomas HD, et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly (ADP-ribose) polymerase. Nature, 2005,434(7035): 913?917.
[4]Beneke S, Bürkle A. Poly (ADP-Ribosyl) ation and aging. Exp Gerontol, 2004, 39(11): 234?241.
[5]Langelier MF, Planck JL, Roy S, et al. Structural basis for DNA damage-dependent poly(ADP-ribosyl) ation by human PARP1. Science,2012, 336(6082):728?732.
[6]Burtscher HJ, Auer B, Klocker H, et al. Isolation of ADP-ribosyltransferase by affinity chromatography. Anal Biochem, 1986, 152(2):285?290.
[7]Kaiser P, Auer B, Schweiger M. Inhibition of cell proliferation inSaccharomyces cerevisiaeby expression of human NAD+ADP-ribosyltransferase requires the DNA binding domain (“zinc fingers”). Mol Gen Genet, 1992,232(2): 231?239.
[8]Fritz G, Auer B, Kaina B. Effect of transfection of human poly (ADP-ribose) polymerase in Chinese hamster cells on mutagen resistance. Mutat Res,1994, 308(2): 127?133.
[9]Giner H, Simonin F, de Murcia G, et al.Overproduction and large-scale purification of the human poly (ADP-ribose) polymerase using a baculovirus expression system. Gene, 1992, 114(2):279?283.
[10]Putt KS, Hergenrother PJ. An enzymatic assay for poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) via the chemical quantitation of NAD+: application to the high-throughput screening of small molecules as potential inhibitors. Anal Biochem, 2004, 326(1):78?86.
[11]Liu J, Zhang LY. HTS model for poly(ADP-ribose)polymerase-1 inhibitors. Chin Pharmacol Bull,2007, 23(1): 124?127 (in Chinese).
柳軍, 張陸勇. 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 抑制劑高通量篩選模型. 中國藥理學(xué)通報, 2007,23(1): 124?127.
[12]Dantzer F, Amé JC, Schreiber V, et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation during DNA damage and repair. Meth Enzymol, 2006, 409: 493.
[13]Kummar S, Chen A, Ji J, et al. Phase I study of PARP inhibitor ABT-888 in combination with topotecan in adults with refractory solid tumors and lymphomas. Cancer Res, 2011, 71(17): 5626?5634.
[14]Samol J, Ranson M, Scott E, et al. Safety and tolerability of the poly (ADP-ribose) polymerase(PARP) inhibitor, olaparib (AZD2281) in combination with topotecan for the treatment of patients with advanced solid tumors: a phase I study. Invest New Drugs, 2011, 30(4): 1?8.
[15]Domagala P, Lubinski J, Domagala W, et al.Iniparib in metastatic triple-negative breast cancer.New Engl J Med, 2011, 364(18): 1780?1781.
[16]Shivaani K, Alice C, Ralph EP, et al. Advances in using PARP inhibitors to treat cancer. BMC Medicine, 2012, 10(1): 25?30.
[17]Pothuri B, Sparano J, Blank S, et al. Phase I study of the PARP inhibitor ABT-888 (veliparib) and pegylated liposomal doxorubicin (PLD) in recurrent ovarian (ov) and breast (br) cancers.Gynecol Oncol, 2012, 125: 22.
[18]Patel AG, De Lorenzo SB, Flatten KS, et al. Failure of iniparib to inhibit poly (ADP-Ribose) polymerasein vitro. Clin Cancer Res, 2012, 18(6): 1655?1662.
[19]Wang F, Diao Y, Xiao WD, et al. Large-scale production of recombinant adeno-associated virus(rAAV). Chin J Biotech, 2009, 25(11): 1608?1613(in Chinese).
王峰, 刁勇, 肖衛(wèi)東, 等. 重組腺相關(guān)病毒規(guī)模化生物包裝技術(shù). 生物工程學(xué)報, 2009, 25(11):1608?1613.
[20]Caiafa P, Guastafierro T, Zampieri M, et al.Epigenetics: poly (ADP-ribosyl) ation of PARP-1 regulates genomic methylation patterns. FASEB J,2009, 23(3): 672?678.