李福偉，李淑青，逯巖，雷秋霞，韓海霞，周艷，武彬 ，曹頂國

1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250023

2 山東省家禽育種工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250023

3 山東省農(nóng)業(yè)管理干部學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100

雞主要組織相容性復(fù)合體 (Major histocompatibility complex，MHC) 是指16號染色體上的一組緊密連鎖高度多態(tài)的基因座，與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)。MHC B-L抗原主要存在抗原遞呈細(xì)胞的表面，為免疫相關(guān)抗原，參與免疫過程中T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互反應(yīng)。地方品種具有優(yōu)良的遺傳特性，其適應(yīng)性、抗病性強(qiáng)等優(yōu)良特點(diǎn)是進(jìn)行資源保存以及培育新品種 (系) 良好素材。MHC各基因成員的遺傳多態(tài)性直接反映了其DNA遺傳變異的程度，也為研究其遺傳進(jìn)化規(guī)律和遺傳多樣性提供分子依據(jù)。研究地方品種MHC B-L BII多態(tài)性與免疫性狀的關(guān)系，篩選與免疫性狀顯著相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)，為下一步抗病育種分子機(jī)制提供理論和技術(shù)支持，也為開展標(biāo)記輔助抗病育種工作奠定基礎(chǔ)。

雞MHC又被命名為B復(fù)合體，主要包括3個高度多態(tài)的基因座：B-F、B-L和B-G基因，分別編碼細(xì)胞表面的MHCⅠ類、Ⅱ類和Ⅳ類糖蛋白分子，即高度多態(tài)的細(xì)胞表面抗原[1]。雞MHCⅡ類分子編碼基因包括A和B兩種基因，分別編碼MHCⅡ類抗原的 α和 β肽鏈，其中B基因位于MHC區(qū)域。α和β鏈均可分為3個部分：C端的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)以及N端的胞外區(qū)。胞外區(qū)包括兩個結(jié)構(gòu)域，即α鏈上為 α1、α2結(jié)構(gòu)域，β鏈上為 β1、β2結(jié)構(gòu)域 (α l、α2和 β l、β2均約為90個氨基酸殘基)，與免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)域相似。β1變異性較高，呈現(xiàn)出較豐富的多態(tài)性，有利于機(jī)體結(jié)合不同的抗原肽[2]。

有報道雞MHC基因的多態(tài)性與免疫性狀特別是雞馬立克氏病 (MD)、布氏桿菌、新城疫(ND) 以及綿羊紅細(xì)胞 (SRBC) 抗體[3]、傳染性法氏囊病毒抗體[4]之間存在相關(guān)性。Dalgeerd等[5]研究發(fā)現(xiàn)，雞只感染 MDV后，在抗性與易感基因型雞淋巴細(xì)胞表面MHCⅠ類和Ⅱ類分子表達(dá)有明顯差異，說明MHC基因型決定了免疫反應(yīng)性質(zhì)及其強(qiáng)弱。越來越多研究結(jié)果揭示動物MHC基因型在抗病免疫中的作用[6]。Liu等[7]研究表明MHC介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答與雞傳染性支氣管病毒有關(guān)。雞MHC基因結(jié)構(gòu)研究方面，Chen等[8]克隆了中國3個地方品種MHC B-II(B-L) 基因cDNA序列，發(fā)現(xiàn)35個等位基因，多態(tài)性位點(diǎn)主要集中在B-Lβ鏈的肽鏈結(jié)合區(qū)域，B-Lα鏈多態(tài)性較少。對病原抗原遞呈影響也有諸多研究。Mona等[9]、Goto等[10]、Ling等[11]研究指出免疫功能較高的主要抗原肽的等位基因頻率也較高。Alcaide等[12]研究指出病原體多樣性在MHC基因形成過程中起到主要作用。

目前，關(guān)于雞MHC基因研究大都證明雞MHC基因結(jié)構(gòu)組成以及MHC基因組內(nèi)具有豐富的多態(tài)性。但是不同地方品種間、品種內(nèi)的SNP位點(diǎn)變異與不同疾病、不同免疫性狀的關(guān)系還鮮有報道。本研究以山東地方家禽品種 (汶上蘆花雞、濟(jì)寧百日雞、萊蕪黑雞) 為研究對象，以SRBC抗體滴度、禽流感AI和ND抗體滴度等免疫功能性狀為主要目標(biāo)性狀，測定比較這些品種主要免疫性狀在品種間和品種內(nèi)的差異；對不同品種的MHC基因B-L BII區(qū)域進(jìn)行遺傳學(xué)變異的分析，尋找這些基因與免疫功能顯著相關(guān)的突變位點(diǎn)，探討B(tài)-LBII基因突變位點(diǎn)與免疫性狀的關(guān)系，為不同品種的免疫差異性提供分析依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及免疫程序

山東地方雞種汶上蘆花雞 (LH)、萊蕪黑雞(LWH) 和濟(jì)寧百日雞 (BR)，均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽所原種雞場提供，在相同條件下飼養(yǎng)，營養(yǎng)水平和免疫程序相同。整個試驗(yàn)期雞群健康狀況良好。按照當(dāng)?shù)丶膊×餍星闆r制定免疫程序，免疫劑量按說明書進(jìn)行。整個試驗(yàn)期免疫程序如下表1。

1.2 檢測指標(biāo)和方法

1.2.1 樣品數(shù)量

每品種隨機(jī)選擇 100只 (公母各半) 采血，所有樣品均使用同一批試劑，在相同條件下抗體測定和提取基因組DNA。

1.2.2 綿羊紅細(xì)胞抗體滴度

取新鮮綿羊血 (小尾寒羊，由濟(jì)南市畜牧局畜牧技術(shù)推廣站提供)，玻璃珠抗凝，阿氏液1∶1保存，磷酸鹽緩沖液 (PBS，pH 7.4) 洗滌后，用0.9%生理鹽水配成 25%的血細(xì)胞溶液 (注射使用) 和2%的紅細(xì)胞懸濁液 (測抗體使用)。試驗(yàn)雞128 d腿部肌肉注射1 mL，左右腿各0.5 mL，免疫后第6天采血取血清。

表1 試驗(yàn)雞群免疫程序Table 1 Experimental immunization program in chickens

用紅細(xì)胞凝集法測定SRBC抗體滴度。待測血清56 ℃水浴滅活30 min后，在微量血凝板的第一孔中加入50 μL PBS和50 μL血清，血凝板(加蓋) 在培養(yǎng)箱中37 ℃溫育30 min，結(jié)束后在血凝板剩余的每孔中加入50 μL PBS，用微量移液器逐孔倍比稀釋樣品 (最后一孔棄掉)。在所有的孔中加入50 μL 2% SRBC懸濁液，37 ℃溫育30 min后，取出血凝板，視紅細(xì)胞凝集情況判斷效價[13]。

1.2.3 AI和ND抗體滴度的測定

試驗(yàn)雞于134 d進(jìn)行翅靜脈采血，每只雞采血 2 mL，取血清分別按《高致病性禽流感診斷技術(shù)》 (GB/T 18936-2003)[14]和《新城疫診斷技術(shù)》 (GB/T 16550-2008)[15]的規(guī)定，測定 AI和ND的血凝抑制抗體效價。

1.2.4 DNA提取

采用鹽析法抽提DNA[16]。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR-SSCP反應(yīng)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

利用Primer 5.0軟件，根據(jù)雞MHC B-L BII基因序列 (GenBank Accession No. M29763，為雞MHC B-L BII?基因全部CDS區(qū)域，該基因片段長度為2 405 bp) 設(shè)計(jì)引物，引物序列如表2所示。目的片段長度為175 bp，為MHCB-L BII基因exon2的一部分。

表2 文中所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.3.2 PCR-SSCP

應(yīng)用 PCR-SSCP技術(shù)對 3個地方雞品種的300個個體進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)總體積為10 μL：模板 (3 個地方品種雞 DNA) 0.8 μL，上游引物 0.2 μL，下游引物 0.2 μL，ddH2O 3.8 μL，2×TaqPCR Master Mix 5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸6 min。

PCR結(jié)束后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。配制10%的聚丙烯酰胺凝膠：10×TBE 9 mL，30%聚丙烯酰胺31 mL，50%甘油9 mL，ddH2O 44 mL，過硫酸銨 630 μL，TEMED 70 μL。電泳程序?yàn)椋?00 V 30 min；PCR產(chǎn)物98 ℃變性8 min，加樣2.5 μL/孔；250 V 高壓 30 min；4 ℃條件下 120 V恒壓下電泳16 h后銀染顯色。每個品種每個基因型送3個純化樣品在濟(jì)南力戈科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析采用 SAS 6.0ANOVA程序進(jìn)行免疫性狀與基因型的最小二乘分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫指標(biāo)測定結(jié)果

三個地方雞品種的SRBC、ND、H5、H9抗體滴度詳見表3。SRBC免疫抗體滴度、ND免疫抗體滴度、H5免疫抗體滴度和H9抗體滴度均以萊蕪黑雞最高，并且與其他2個品種間差異極顯著 (P<0.01)；汶上蘆花雞、濟(jì)寧百日雞ND抗體滴度差異極顯著 (P<0.01)，其他3種抗體滴度間差異不顯著 (P＞0.05)。

2.2 核酸、氨基酸變異分析結(jié)果

根據(jù)對175 bp的PCR-SSCP結(jié)果分型，3個地方雞品種共存在 16種基因型，其中汶上蘆花雞、濟(jì)寧百日雞和萊蕪黑雞分別存在10、10和7種基因型。將測序結(jié)果用 DNAStar軟件中的SeqMan程序與 GenBank中MHCB-L BII基因(Accession No. M29763) exon 2的DNA序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明被檢雞的MHC B-L BII基因exon2存在28個SNP位點(diǎn)，可引起23個氨基酸的變化。其中3個品種共享12個位點(diǎn) (表4)。

表3 抗體滴度測定結(jié)果Table 3 Antibody titers

表4 三個地方雞種MHC B-L BII區(qū)基因SNPs以及所引起的氨基酸變異Table 4 SNPs in MHC B-L BII and amino acid mutations in three indigenous chicken populations

2.3 三個地方雞種 MHC B-L BII基因不同SNP位點(diǎn)與免疫指標(biāo)的相關(guān)性

對 3個地方雞品種MHC B-L BII區(qū)基因exon2的SNP位點(diǎn)與免疫性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表5所示。在28個SNP位點(diǎn)中，與SRBC特異性抗體滴度顯著相關(guān)的位點(diǎn)有 5個位點(diǎn)(P＜0.05)，與H5抗體滴度有顯著相關(guān)的位點(diǎn)有5個位點(diǎn) (P＜0.05)，與H9抗體滴度有顯著相關(guān)的位點(diǎn)有 4個 (P＜0.05)，與 ND抗體滴度顯著相關(guān)的位點(diǎn)有9個 (P＜0.05)。除A99G、T128C外，其余7個位點(diǎn)在3個品種中同時存在變異。位點(diǎn)G97A、T138A位點(diǎn)在3個品種中均有變異，并且位點(diǎn)T97A在濟(jì)寧百日雞中的變異與ND抗體滴度顯著相關(guān) (P<0.05)，在萊蕪黑雞中與SRBC抗體滴度顯著相關(guān) (P<0.05)，在汶上蘆花雞中與 H9抗體滴度顯著相關(guān) (P<0.05)；位點(diǎn)T138A在汶上蘆花雞和濟(jì)寧百日雞中與H9抗體滴度顯著相關(guān) (P<0.05)，由絲氨酸突變?yōu)樯彼?；這兩個位點(diǎn)與綿羊紅細(xì)胞抗體、新城疫、禽流感抗體滴度均顯著相關(guān) (P<0.05)。

表5 三個地方雞種MHC B-L BII不同位點(diǎn)與免疫指標(biāo)的相關(guān)性Table 5 Relationships between different sites of MHC B-L BII and the immune traits in three breeds

3 討論

3.1 三個地方雞品種間抗體滴度的比較分析

本研究結(jié)果表明：3個地方雞品種免疫 6 d后 SRBC 抗體滴度均值在 (6.94±0.15)～(8.00±0.16)，與吳春梅[17]報道的北京油雞和來航蛋雞 SRBC免疫后 6 d的抗體滴度的均值在6.9～9.1結(jié)果相近。3個品種中萊蕪黑雞的SRBC抗體滴度最高，其相應(yīng)的ND、H5和H9抗體滴度也高，并與另外兩個品種差異極顯著 (P＜0.01)。

SRBC是一種多價的非致病性抗原，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。Siegel等[18]研究報道，SRBC的抗體滴度的水平代表了機(jī)體產(chǎn)生抗體總量的能力。由研究結(jié)果推斷，萊蕪黑雞在這3個品種中機(jī)體產(chǎn)生總體抗體能力最強(qiáng)。Parmentier等[19]證實(shí)，SRBC抗體滴度高的家系對感染性疾病的抗性優(yōu)于抗體滴度低的家系，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)的3個地方品種在SRBC、H5和H9 3個指標(biāo)中抗體滴度高低為LWH＞BR＞LH，在一定程度上說明LWH比BR和LH產(chǎn)生總體抗體滴度的能力強(qiáng)。但是在ND抗體滴度指標(biāo)中，抗體滴度高低依次為 LWH＞LH＞BR，仍然是LWH最高，BR最低。導(dǎo)致ND抗體滴度與另外3個抗體滴度不一致的原因還需要進(jìn)一步研究。但本研究從總體上能夠說明 SRBC抗體滴度的高低代表了機(jī)體產(chǎn)生抗體能力的高低，SRBC抗體滴度高，其他相應(yīng)的指標(biāo)也相對較高。同時該研究結(jié)果也為3個地方品種的臨床疫苗的使用提供理論參考。

3.2 三個地方雞品種MHC B-L BII基因多態(tài)位點(diǎn)及其與免疫指標(biāo)相關(guān)性的比較分析

三個地方品種雞MHC B-L BII基因具有豐富的多態(tài)性，并且多態(tài)性更多的體現(xiàn)在氨基酸變異上。本研究通過對 3個山東地方雞種MHC B-L BII基因的研究，在MHC B-L BIIexon 2上發(fā)現(xiàn)了28個變異位點(diǎn)，其中有12個變異位點(diǎn)為3個品種所共有。在汶上蘆花雞、萊蕪黑雞和濟(jì)寧百日雞中分別檢測到 19、19和 22個變異位點(diǎn)，3個地方品種核苷酸同源性 (89.14%、89.14%和87.42%) 高于氨基酸同源性 (62.7%、62.7%和58.1%)。本研究選取山東地方家禽品種資源為研究對象，一定程度上證明了MHC B-L BII基因在不同地方品種資源間存在高度多態(tài)性。

本研究結(jié)果與劉立波等[20]、張澤樘等[21]、顧玉蘭等[22]研究地方品種MHC B-L基因的結(jié)果基本一致，都從不同品種中證實(shí)了MHC B-L高度的遺傳變異，并且核苷酸同源性高于氨基酸的同源性。劉立波等[20]結(jié)果表明：在 9個地方品種(246個樣本)MHC B-L基因exon 2的整個exon 2 267 bp核苷酸序列內(nèi)，共發(fā)現(xiàn)了84個突變，突變率為0.3146，充分顯示出了MHC B-L基因豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力。而張澤樘等[21]對400個麻羽雞DNA樣品MHC B-L基因外顯子2進(jìn)行測序，共篩查到42個SNP位點(diǎn)，該序列所編碼的90個氨基酸殘基中，共發(fā)現(xiàn)有27個氨基酸殘基發(fā)生改變，核苷酸序列的同源性(84.4%) 高于氨基酸序列的同源性 (70%)。顧玉蘭[22]在 6個地方品種發(fā)現(xiàn)MHC B-LBⅡ基因外顯子2核苷酸序列的同源性 (93.75%) 高于氨基酸序列的同源性 (91.37%)。徐日福[23]、李尚民等[24]的研究也有類似的結(jié)論。這些研究共同點(diǎn)大都針對地方品種MHC B-L BII基因多態(tài)性，并沒有進(jìn)行多態(tài)性與免疫性狀之間的關(guān)聯(lián)分析。

本研究進(jìn)行了3個地方品種MHC B-L BII基因多態(tài)性位點(diǎn)與 SRBC、ND、H5和 H9抗體滴度的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明地方品種MHC B-L BII基因多態(tài)性與測定的免疫性狀存在不同程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn) 14個 SNPs位點(diǎn)與 SRBC、ND、H5和H9抗體滴度顯著相關(guān) (P＜0.05)。通過研究4個抗體指標(biāo)抗體水平的高低，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些SNP位點(diǎn)是相重合的，并且和ND抗體應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有9個。這就暗示了在以后的選擇中，4個指標(biāo)中只選擇ND作為免疫指標(biāo)就基本代表了這4個指標(biāo)相對較高。劉立波對500只白來航蛋雞為研究對象，發(fā)現(xiàn)37個突變位點(diǎn)中，與IgG含量、LPS含量、AI、ND和SRBC抗體滴度顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)分別有5、1、11、18和6個，也獲得同樣的結(jié)論。翟飛等[25]用微衛(wèi)星方法對雪山雞MHC B區(qū)多態(tài)性以及血型與IgM、IgG等免疫指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得出B2血型綜合抗性指數(shù)好于其他血型 (P＜0.05)。

本研究通過3個地方品種的不同類型免疫滴度等免疫性狀的測定及與基因變異的關(guān)聯(lián)分析，表明不同免疫能力存在個體甚至品種水平上的遺傳差異，不同免疫性狀存在顯著的優(yōu)勢基因型，這在一定程度上也更能說明選擇免疫性狀進(jìn)行遺傳標(biāo)記選擇的可能性，通過標(biāo)記輔助選擇提高個體或者群體的抗病力是可行的。

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