龍 逢 王筱靜 陳 星 陳 剛

精神分裂癥是一種重型精神疾病，以思維、情感、行為障礙與相互不協(xié)調(diào)為主要特征。在一般人群中終生患病率約為6.55‰［1］，至今病因未明。家系調(diào)查、雙生子及寄養(yǎng)子研究均顯示遺傳因素與發(fā)病密切相關(guān)［2～4］，遺傳方式復雜，顯性、隱性及多基因遺傳方式均有報道。迄今發(fā)現(xiàn)，許多基因與精神分裂癥相關(guān)聯(lián)，其中DISC1(精神分裂癥斷裂基因1)被列為重要的易感基因，我們的Affymetrix人類SNP6.0芯片對兩組精神分裂癥的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果也均發(fā)現(xiàn)與此基因存在關(guān)聯(lián)(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。本研究采用了高分辨率熔解曲線(HRM)分析的技術(shù)方法，對DISC1基因的全部外顯子區(qū)域在96例精神分裂癥患者和96例正常對照者進行了突變篩查，結(jié)果報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2004年8月在山東省濟南市精神衛(wèi)生防治中心與濟南市歷城區(qū)錦繡川精神病療養(yǎng)院醫(yī)院住院的精神分裂癥患者(以下簡稱患者)96例;正常對照者96例(以下簡稱對照者)取自山東省血液中心獻血者。所有患者均符合國際疾病分類第十次修訂本(ICD-10)精神分裂癥診斷標準，其中男73例，女23例，年齡23～73 歲，平均年齡(40.80 ±9.49)歲，平均發(fā)病年齡(26.68±5.70)歲，患者間均無血緣關(guān)系。對照者中男63例，女33例，年齡18～53歲，平均年齡(23.09±3.01)歲。本研究得到了山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所倫理委員會的批準，并獲得了患者與對照者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備 抽取患者與對照者的外周靜脈血5 ml，用EDTA做抗凝處理后－20℃冷凍保存。DNA采用廈門百維信生物科技有限公司 (Bio-V)的Lab-Aid 820自動核酸提取儀與500 μl全血磁珠提取核酸試劑提取。DNA濃度用美國賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific的NanoDrop 2000分光光度計檢測，每個樣本測定兩次，取其平均值。如果兩次誤差超過10%，則進行第3次測定后取兩個相近數(shù)值的平均值。最后將所有DNA樣品稀釋至終濃度1 ng/μl，用96深孔板(2 ml)－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA模板分裝 用美國 APRICOT DESIGNs Personal Pipette PP-550N-XD移液工作站分裝5 μl(5 ng)至96孔PCR板(寧波)。

1.2.3 引物設計與合成 選用美國加州大學的基因組生物信息學網(wǎng)站UCSC Genome Bioinformatics(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)，輸入DISC1基因，在眾多轉(zhuǎn)錄本中選擇最長(外顯子最多)的一 個，在 HumanGeneDISC1(uc010pxh.2)Description and Page Index頁面，通過 Exon Primer(外顯子引物)，選擇Entire(全部)cDNA;引物序列提交上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，見表1。

1.2.4 PCR 反應 基因組 DNA 5 μl(1 ng/μl)，10 ×EasyTaq buffer 2.0 μl(Trans Gen Biotech 全式金)，10 mM dNTPs 0.2 μl，5 μM Primer FR(左右)各 1.2 μl，5 μM SYTO9(飽 和 熒 光 染 料)1.5 μl，Easy Taq polymerase(Trans Gen Biotech 全式金)(5 U/μl)0.2 μl，加 ddH2O 9.1 μl使總反應體系為 20 μl。PCR 反應在美國 Applied Biosystem，ABI公司的 GeneAmp PCR System 9700擴增儀上進行，其反應條件如下:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，56～59℃ 退火2 min，72℃延伸30 s，共50個循環(huán);然后72℃保溫7 min，最后保存于25℃。

1.2.5 高分辨率熔解曲線分析基因掃描 (High Resolution Melting for Gene Scan) 對DISC1外顯子序列的突變檢測采用了美國公司的高分辨熔解曲線基因突變/基因分型檢測系統(tǒng)(Idaho Technology，Light Scanner HI 96)。高分辨熔解曲線分析采用LightScanner(HRM)高分辨率熔解曲線突變檢測/基因分型分析系統(tǒng)，溫度設置從65℃升至95℃。

1.2.6 統(tǒng)計分析 對最終得到的所有26對引物擴增后的PCR產(chǎn)物的基因掃描通過隨機所帶的Instrument＆Analysis軟件，Light Scanner wit Call-IT 2.0軟件完成。首先在 http://www.biophys.uni-duesseldorf.de/local/POLAND/.silico得到經(jīng)由電腦模擬的PCR產(chǎn)物的熔解曲線(見圖1)，將其與實驗中真實得到的PCR熔解曲線進行對比，通過對比吻合情況檢驗PCR擴增質(zhì)量。熒光染料結(jié)合在DNA雙鏈，當溫度逐漸上升到一定程度，雙鏈的PCR產(chǎn)物就會解鏈，熒光染料會隨之開始逐漸脫落，完全解鏈后會全部脫落，這種變化會通過熒光曲線的下降直觀地反映出來。如果對照者與患者在這一段PCR產(chǎn)物的DNA序列完全一致，那么二者得到熔解曲線形狀就會完全吻合。有突變時解鏈的溫度會出現(xiàn)改變，表現(xiàn)為熔解曲線形狀改變。因此，通過與對照者熔解曲線作對比，會發(fā)現(xiàn)患者存在的突變。另外，患者與對照者的一般統(tǒng)計學數(shù)據(jù)通過Microsoft Office Excel XP軟件完成。

圖1 DISC1 Exon13.4理論模擬PCR產(chǎn)物熔解曲線

表1 精神分裂癥DISC1基因外顯子突變檢測引物序列

對DISC1基因全部13個外顯子的序列用26對引物經(jīng)過PCR擴增后進行了高分辨率熔解曲線突變檢測，將96例患者與96例對照者的熔解曲線進行逐一對比，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)突變，見圖2。

2 結(jié)果

圖2 DISC1 Exon13.496例對照者與96例患者的熔解曲線

3 討論

DISC1位于1號染色體的q42.2;全長約410 kb，包含13個外顯子，已發(fā)現(xiàn)有16個轉(zhuǎn)錄本。此基因編碼854個氨基酸的蛋白質(zhì)，包括一個富含絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸的球狀N段區(qū)和一個由3～13號外顯子編碼形成的卷曲的C段區(qū)。羧基端區(qū)域富含許多環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，有利于 DISC1與其他蛋白間的結(jié)合［5，6］。

1990 年，St.Clair［7］對蘇格蘭某精神病高發(fā)家系的研究發(fā)現(xiàn)該家系中精神疾病患者的1q42存在易位突變。其平衡易位斷點部位位于染色體(1;11)(q42.1;q14.3)。2000 年，Millar等［8］發(fā)現(xiàn)了兩個直接被易位突變影響的基因，并命名為DISC1和DISC2。Millar認為這兩個基因是精神疾病的易感基因。

DISC1在成體和胚胎的許多組織中都有表達，在胎盤和腦中表達較高，在神經(jīng)元的軸突末端、突觸后區(qū)域、線粒體、中心體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細胞核均有表達［9］。DISC1在腦組織中的發(fā)育是一個動態(tài)變化的過程，在人類發(fā)育的不同階段，各個部位表達的高低不同。這種表達模式表明DISC1基因在神經(jīng)元發(fā)育和成熟過程中起到重要作用［10］。

DISC1與許多基因相互作用構(gòu)成了精神疾病發(fā)病機制。2003年，Morris等［11］發(fā)現(xiàn)DISC1與多種中心體的和細胞骨架系統(tǒng)的蛋白如MIPT3，MAP1A，NUDEL，細胞膜上的受體蛋白如ACTN2，以及受體信號轉(zhuǎn)換蛋白如ATF4，ATF5相互作用。DISC1還參與了 LIS1/NUDE/NUDEL通路參與的微管活動，與微管蛋白和中心粒旁素也有結(jié)合，DISC1以及DISC1/NUDEL的結(jié)合參與了對神經(jīng)突生長的調(diào)控。DISC1上有特殊的區(qū)域用于與以上蛋白的相互作用，敲除DISC1或突變的DISC1與以上蛋白的結(jié)合和相互作用發(fā)生改變，從而影響神經(jīng)突的生長發(fā)育，以及影響細胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運等生理活動。所以Morris等認為DISC1基因產(chǎn)物是多功能蛋白，DISC1基因的突變會破壞細胞間傳導、神經(jīng)突構(gòu)造和神經(jīng)元遷移，從而導致精神分裂癥易感性升高。

2005年，Millar等［12］發(fā)現(xiàn) DISC1與磷酸二酯酶-4B(PDE4B)的UCR2區(qū)的結(jié)合和相互作用與精神分裂癥的易感有關(guān)。這個結(jié)合是cAMP依賴性的，細胞cAMP水平升高可導致PDE4B與DISC1分離并恢復PDE4B的活性。DISC1可以通過與PDE4B的結(jié)合對其活性產(chǎn)生調(diào)控，這個過程可能與精神疾病的發(fā)病有關(guān)。

2009年，Mao等［13］研究發(fā)現(xiàn) DISC1 通過調(diào)節(jié)GSK3-beta(糖原合成酶激酶3β)的活性和beta-catenin控制神經(jīng)前體細胞增殖。DISC1直接作用于Gsk3β，并抑制重組體Gsk3β的活性，導致其磷酸化水平降低，β-catenin的穩(wěn)定性升高。DISC1敲減的成年小鼠大腦齒狀回極度活躍并出現(xiàn)抑郁樣行為，但這些DISC1敲減引起的作用可被藥物抑制Gsk3β改變。

2003年，Hennah等［14］發(fā)現(xiàn) DISC1基因上的一個重要區(qū)域HEP3。HEP3是一個跨越DISC1基因第一內(nèi)含子到第二外顯子的單體型，包含 2個 SNP。Hennah等發(fā)現(xiàn)HEP3在芬蘭女性患者中不能有效的傳遞。HEP3單體型的傳輸失真具有性別差異，只在女性患者中不能有效傳遞。2004年，Hodgkinson等［15］通過對北美人群的病例對照研究證實HEP3單倍體的不充分表達與情感性精神分裂癥相關(guān)，同時從第1外顯子到第9外顯子的4個單倍型域中的多個單倍體型與精神分裂癥、情感性精神分裂癥、雙向情感障礙有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)情感性精神分裂癥患者的DISC1基因上leu-607-pro有錯義突變過度表達現(xiàn)象。

基因的外顯子作為基因內(nèi)的編碼序列，顯示轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后在蛋白質(zhì)生物合成過程中翻譯成蛋白質(zhì)。因此，外顯子突變將影響基因的表達，并影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，導致各種精神疾病的發(fā)生。對外顯子突變的檢測將有助于我們研究DISC1基因?qū)窦膊∫赘行缘挠绊?，并發(fā)現(xiàn)其影響精神疾病發(fā)病的病理生理機制。

高分辨率熔解曲線是由美國猶他大學保健科學中心病理學部Carl Wittwer實驗室與美國Idaho公司于2003年共同開發(fā)的一種建立在實時熒光定量PCR基礎上的技術(shù)，是通過飽和染料監(jiān)控核酸的熔解曲線變化從而對DNA結(jié)構(gòu)進行分析的一種技術(shù)。其原理是在DNA擴增的過程中加入飽和染料，并使飽和染料鑲嵌在擴增的DNA雙鏈之間。因此，一段雙鏈DNA分子在被加熱變性時，根據(jù)其GC含量和分布的差異，在不同的溫度解鏈，釋放出飽和染料，從而形成不同的熔解曲線。HRM檢測不受突變堿基位點和種類的局限，具有高靈敏度特異性、簡單方便、成本低、高通量等優(yōu)點，可應用于基因分型和突變檢測等方面。本實驗使用HRM技術(shù)檢測了DISC1基因全部13個外顯子的突變情況，體會了檢測過程的快速、簡便、高通量，并且靈敏性和特異性較高［16～20］。

在此之前，Hennah［14］，Hodakinson［15］等均對DISC1基因進行過突變研究，然而卻只是針對某個或某些位點進行研究，本實驗對DISC1基因的全部13個外顯子進行設計合成了引物，對所有96個精神分裂癥樣本都進行了檢測，因此，是針對DISC1在精神分裂癥的一項系統(tǒng)而全面的實驗。其結(jié)果未發(fā)現(xiàn)突變的原因可能有以下兩點:(1)用于研究的患者樣本數(shù)量不夠大;(2)DISC1基因涉及精神分裂癥病因DNA變異存在于外顯子之外的其他DNA序列中，而外顯子中根本就不存在突變。

總之，本文系統(tǒng)全面地完成了對96例精神分裂癥患者的DISC1基因全部13個外顯子的突變檢測，未能發(fā)現(xiàn)突變，這對以后的研究有重要參考意義。同時也提示研究既要重視DISC1基因外顯子區(qū)域(如:進一步擴大研究樣本)，更要著眼于其外顯子之外的DNA區(qū)域(如:基因調(diào)控區(qū)，剪切與內(nèi)含子區(qū)域等)。

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