王虎斌，韋超，趙日秋，喬紅群#（.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京0009；.南京生命能科技開發(fā)有限公司，南京 006）

拉坦前列素（Latanoprost）是1996年開發(fā)出的治療青光眼和高眼壓的新藥。其是一種新型苯基替代的丙基酯前列素F2a，為選擇性F2a受體激動(dòng)藥，無(wú)活性但能迅速滲透到角膜里，在角膜和血漿中可水解為具有活性的游離酸。拉坦前列素用量小，但房水通過眼角素層的流出量大，藥液能滲透到眼球上睫脈絡(luò)膜上層，具有良好降眼壓效果[1-2]。自前列腺素衍生物應(yīng)用以來，國(guó)內(nèi)外已有許多研究[3-4]證明，拉坦前列素對(duì)原發(fā)性開角型青光眼和高眼壓癥有明顯的降眼壓作用。目前國(guó)家要求市場(chǎng)上的滴眼液必須選擇合適的抑菌劑，苯扎氯銨是一種陽(yáng)離子表面活性劑，屬非氧化性殺菌劑，具有廣譜、高效的抑菌效力，且用量適當(dāng)時(shí)無(wú)任何不良反應(yīng)，故本試驗(yàn)中采用苯扎氯銨作為拉坦前列素滴眼液的抑菌劑。另根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，綜合考慮苯扎氯銨的有效劑量以及眼部毒性，對(duì)0.005%（0.005g/100ml）、0.01%、0.015%、0.02%4個(gè)處方量進(jìn)行本次研究的篩選。本研究根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（二部）抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則[6]要求，測(cè)定含不同處方量抑菌劑的拉坦前列素滴眼液對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效力，從而確定處方中苯扎氯銨的使用量。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備

AKL1300C超凈臺(tái)（蘇州市艾可林實(shí)驗(yàn)動(dòng)物器材廠）；臺(tái)式滅菌器3870（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；微量移液槍（德國(guó)Ependoff公司，規(guī)格：20μl、500μl、5ml）。

1.2 藥品、培養(yǎng)基與試劑

拉坦前列素滴眼液，處方Ⅰ（批號(hào)：20100817-1，0.005%苯扎氯銨）、處方Ⅱ（批號(hào)：20100817-2，0.01%苯扎氯銨）、處方Ⅲ（批號(hào)：20100817-3，0.015%苯扎氯銨）、處方Ⅳ（批號(hào)：20100817-4，0.02%苯扎氯銨）均由南京生命能科技開發(fā)有限公司提供；胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：100518）和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：1003012）均由北京三藥科技開發(fā)公司提供；0.9%氯化鈉注射液（南京小營(yíng)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：2010070106）。

1.3 菌株

銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所提供，所有菌株傳代次數(shù)均為第3代。

2 方法

2.1 檢測(cè)菌菌液制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48h。用0.9%氯化鈉注射液將上述培養(yǎng)物的菌懸液校正至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)濃度（含菌數(shù)約為108CFU/ml），最后用0.9%氯化鈉注射液將菌液1→10稀釋至每1ml含菌數(shù)為50～100CFU的菌懸液。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7d，加入5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉注射液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%氯化鈉注射液制成每1ml含孢子數(shù)50～100CFU的孢子懸液。

2.2 計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別按公式（回收率＝試驗(yàn)組平均菌數(shù)/菌液組平均菌數(shù)×100%）計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。

2.2.1 菌液組。取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌稀釋菌液各1ml，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置于35℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉稀釋菌液各1ml，分別注入無(wú)菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置25℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。

2.2.2 試驗(yàn)組。取4種處方供試液1ml和50～100CFU試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。

2.3 抑菌效力測(cè)定

取包裝完整的4種處方的供試品各20瓶，直接接種“2.1”項(xiàng)下制備的含菌數(shù)約為108CFU/ml的試驗(yàn)菌菌液，每一試驗(yàn)菌菌液接種4瓶，供試品中1ml接種菌數(shù)約為105～106CFU，每支接種菌液的體積25μl，充分混合，使供試品中的試驗(yàn)菌均勻分布。將接種的供試品置于25℃培養(yǎng)28d，避光，同時(shí)在0、7、14、28d分別依法檢測(cè)供試液中的菌落數(shù)。菌落數(shù)檢測(cè)方法：用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將供試液稀釋成1∶10、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶1077個(gè)稀釋級(jí)，取各級(jí)稀釋液1ml，置于無(wú)菌平皿中，注入20ml胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基混勻，待凝固，倒置培養(yǎng)。每個(gè)稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基制備2個(gè)平皿；測(cè)定每份供試品中所含的菌數(shù)。同時(shí)取稀釋液作陰性對(duì)照。根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定，抑菌劑效力根據(jù)各間隔時(shí)間的菌數(shù)lg值相對(duì)于初始值（0時(shí)菌數(shù)lg值）減少程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3 結(jié)果

結(jié)果，4種處方樣品3次計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn)的回收率均在70%以上，表明該樣品可采用普通的菌落計(jì)數(shù)方法。4種處方對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1，4種處方對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效力見圖1。

表1 4種處方對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests for 5kinds of standard strains in 4kinds of formulation

圖1 4種處方對(duì)5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效力A.處方Ⅰ；B.處方Ⅱ；C.處方Ⅲ；D.處方ⅣFig 1 Antibacterial effects of 5standard strains in 4kinds of formulationA.formulationⅠ；B.formulationⅡ；C.formulationⅢ；D.formulationⅣ

從圖1結(jié)果可看出，處方Ⅰ和處方Ⅱ?qū)︺~綠假單孢菌的抑菌效力不符合《中國(guó)藥典》要求，而處方Ⅲ和處方Ⅳ均可以在28d內(nèi)抑制5種標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌體生長(zhǎng)。由于處方Ⅲ的抑菌劑量比處方Ⅳ低，所以拉坦前列素滴眼液中苯扎氯銨的處方量建議為0.015%。

4 討論

拉坦前列素是以異丙酯為存在形式的前體藥物，其通過角膜被吸收，在酯酶的作用下水解成具有生物活性的酸，以增加房水的鞏膜色素膜外流達(dá)到降低眼內(nèi)壓的作用。拉坦前列素因能逐漸改變眼的顏色，而被作為治療開角型青光眼的二線藥物[1]。本試驗(yàn)主要探討了拉坦前列素滴眼液處方中抑菌劑苯扎氯銨的合理含量，為拉坦前列素的臨床應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

2010年版《中國(guó)藥典》中抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則對(duì)眼用制劑抑菌劑的使用有具體的規(guī)定[6]，為抑菌劑的合理使用指明了方向。本次試驗(yàn)主要探討了處方中不同量抑菌劑對(duì)藥物的影響，所以處方中其他組分及其濃度均相同，以后的試驗(yàn)可以對(duì)拉坦前列素滴眼液中其他組分對(duì)處方的影響進(jìn)行研究。

[1] 張翠蓮.拉坦前列素[J].中國(guó)新藥雜志，1998，7（4）：329.

[2] 詹桂林.前列腺素治療青光眼的最新進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)眼科學(xué)分冊(cè)，1997，21（3）：129.

[3] 陳璐，童榮生，呂晶.降眼壓新藥：曲伏前列素[J].中國(guó)藥房，2008，19（25）：1981.

[4] Aptel F，Cucherat M，Denis P.Efficacy and tolerability of prostaglandin analogs：a meta-analysis of randomized controlled clinical trials[J].J Glaucoma，2008，17（8）：667.

[5] 寧黎麗.眼用制劑研發(fā)過程中應(yīng)關(guān)注抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42（23）：1836.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅪⅩN.