張明穎，孫國祥（沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110016）

阿托伐他汀鈣是羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑類調(diào)血脂藥，可降低血清膽固醇和甘油三酯水平，副作用小，臨床用于治療多種高膽固醇血癥和混合性脂代謝紊亂癥[1]。阿托伐他汀鈣原料藥在合成過程中的中間體有4-氟苯基芐基酮（FPAP）、4-甲基-3-氧代-N-苯基戊酰胺（M-2）和（4R-cis）-6-[2-[2-（4-氟苯基）-5-（1-異丙基）-3-苯基-4-[（苯胺）羰基]-1H-吡咯-1-基]乙基]-2，2-二甲基-1，3-二氧六環(huán)-4-乙酸叔丁酯（L-1）[2-4]，3種中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 3種中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig1 Chemical structures of 3 intermediates

為控制該原料藥質(zhì)量，筆者參照有關(guān)文獻[5-11]采用高效液相色譜（HPLC）法對FPAP、M-2和L-1這3種中間體進行含量測定和有關(guān)物質(zhì)檢查，制定3種中間體的合適的質(zhì)量限度以保證阿托伐他汀鈣產(chǎn)品的質(zhì)量合格。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC儀，配有二極管陣列檢測器（DAD）、四元低壓梯度泵和自動進樣器、ChemStation工作站（美國Agilent科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

FPAP、M-2、L-1對照品（批號：091025、091026、091027，純度：99.7%、99.1%、99.8%）與FPAP、M-2和L-1樣品（各3批，批號均為：20100101、20100102、20100103，純度：均＞98.0%）均為自制；甲醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純，枸櫞酸為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液。精密稱取FPAP、M-2和L-1對照品適量，分別使用乙腈-50 mmol/L枸櫞酸銨溶液（pH7.4）（1∶1，V/V）、甲醇-水（80∶20，V/V）和甲醇為配樣溶液制成質(zhì)量濃度分別為20、50、50 μg/ml的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液。精密稱取FPAP、M-2和L-1樣品適量（分別約10、25、25 mg），置于50 ml量瓶中，分別取“2.1.1”項下配樣溶液溶解并定容，搖勻，過濾；取續(xù)濾液適量用配樣溶液制備成質(zhì)量濃度分別為20、50、50 μg/ml的供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

測定3種中間體的色譜柱和流動相組成條件見表1。

表1 測定3種中間體的色譜條件和理論板數(shù)Tab1 Chromatographic conditions and theory plate number of 3 intermediates

其余條件為：流動相流速為1.0 ml/min，柱溫為（30±0.15）℃，檢測波長為244 nm，進樣量為20 μl。精密吸取3種中間體對照品溶液在相應(yīng)色譜條件下進樣測定，理論板數(shù)結(jié)果見表1，表明本色譜條件適用性良好。

2.3 方法專屬性考察

分別取3種中間體各自的配樣溶液、對照品溶液和供試品溶液進樣測定，結(jié)果表明配樣溶液不干擾中間體的含量測定，色譜圖見圖2。

圖2 3種中間體的高效液相色譜圖A.FPAP；B.M-2；C.L-1；a.配樣溶液；b.供試品；c.對照品Fig2 HPLC chromatograms of 3 intermediatesA.FPAP；B.M-2；C.L-1；a.blank solvent；b.test sample；c.substance control

另取3種中間體供試品溶液分別在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下進行破壞試驗，結(jié)果表明主成分峰與各降解產(chǎn)物能達到很好的分離。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取FPAP、M-2、L-1對照品各10 mg，置于50 ml量瓶中，各自加入相應(yīng)的配樣溶液溶解并定容，搖勻，作為貯備液。精密量取各貯備液適量用配樣溶液按表2制備成系列質(zhì)量濃度的標準溶液。分別精密吸取5種系列質(zhì)量濃度的標準溶液各20 μl，在選定的色譜條件下進樣測定2次，記錄色譜圖，以平均峰面積（A）對質(zhì)量濃度（c）進行回歸得到3種中間體的線性方程；調(diào)整對照品溶液的質(zhì)量濃度按3倍信噪比確定檢測限，按10倍信噪比確定定量限，結(jié)果見表2。

2.5 進樣精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率試驗

精密稱取FPAP、M-2和L-1對照品按“2.1.1”項下方法制成3種中間體的對照品溶液，分別精密吸取3種中間體對照品溶液連續(xù)進樣分析5次以考察精密度；FPAP對照品溶液分別在0、2、4、5、6 h進樣測定，M-2和L-1對照品溶液分別在0、1、3、5、7 h進樣測定以考察穩(wěn)定性；按供試品溶液質(zhì)量濃度的80%、100%、120%分別制備3種中間體的對照品溶液，各濃度制備3份，每份測定2次以考察回收率；重復(fù)制備5份供試品溶液分別測定以考察重復(fù)性。各項試驗結(jié)果表明FPAP供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定，M-2和L-1供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定；3種中間體的精密度、準確度、重復(fù)性及樣品穩(wěn)定性均合格，詳見表3。

表2 3種中間體的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Tab2 Linear equation，correlation coefficient，LOD and LOQ of 3 intermediates

表3 3種中間體的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率結(jié)果（%%）Tab3 Precision，stability，repeatability and average recovery of 3 intermediates（%%）

2.6 樣品含量測定

分別精密吸取3種中間體供試品溶液測定2次，以平均峰面積按標準曲線計算3種中間體各3批樣品的含量。結(jié)果，F(xiàn)PAP 3批樣品中FPAP含量分別為98.54%、98.48%、98.77%（≥98%）；M-2 3批樣品中M-2含量分別為98.69%、99.38%、99.13%（≥98%）；L-1 3批樣品中L-1的含量分別為99.13%、99.77%、99.11%（≥99%）。根據(jù)試驗結(jié)果規(guī)定FPAP、M-2和L-1 3種中間體的含量應(yīng)分別不低于98%、98%和99%。

2.7 樣品中有關(guān)物質(zhì)測定

2.7.1 溶液制備。供試溶液制備：取FPAP、M-2和L-1樣品適量以各自的配樣溶液制成質(zhì)量濃度分別為200、500、500μg/ml的供試溶液。對照溶液制備：精密吸取上述1 ml供試溶液，置于100 ml量瓶中，分別加配樣溶液溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.7.2 有關(guān)物質(zhì)測定。分別吸取3種中間體的供試溶液進樣測定，記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍，再吸取對照溶液進樣測定，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的20%，記錄色譜圖。按主成分自身對照法計算3種中間體中有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果3批FPAP樣品中的有關(guān)物質(zhì)分別為0.27%、0.28%、0.28%（＜0.5%），3批M-1樣品中的有關(guān)物質(zhì)分別為0.86%、0.95%、0.92%（＜1%），3批L-1樣品中有關(guān)物質(zhì)分別為0.16%、0.18%、0.15%（＜0.5%）。根據(jù)試驗結(jié)果規(guī)定FPAP、M-2和L-1 3種中間體的有關(guān)物質(zhì)應(yīng)分別小于＜0.5%、1%、0.5%。色譜圖見圖3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

中間體FPAP、M-2和L-1經(jīng)紫外掃描最大吸收波長分別為244、243和240 nm。用相應(yīng)的色譜條件對波長進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種中間體在244 nm波長處均有最大吸收，而且在此波長下由破壞試驗所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均能被靈敏地檢測出，故檢測波長定為244 nm。

圖3 3種中間體有關(guān)物質(zhì)測定的高效液相色譜圖Fig3 HPLC chromatograms of related substances of 3 intermediates

3.2 流動相及配樣溶液的選擇

筆者對中間體FPAP的流動相進行篩選，發(fā)現(xiàn)在阿托伐他汀鈣原料藥的色譜條件下可以實現(xiàn)FPAP與其有關(guān)物質(zhì)的有效分離，為了后續(xù)的相關(guān)研究，故采用乙腈-四氫呋喃-枸櫞酸銨體系作為FPAP的流動相，并采用乙腈-枸櫞酸銨為配樣溶液。

對中間體M-2和L-1的流動相進行篩選考察時，發(fā)現(xiàn)原料藥的色譜條件不能使二者與有其關(guān)物質(zhì)有效分離，因為M-2和L-1均易溶于甲醇，考慮到毒性及成本的因素故采用甲醇-水體系考察二者的流動相組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當M-2的流動相甲醇-水比例為60∶40時主峰與有關(guān)物質(zhì)分離良好，在此基礎(chǔ)上提高有機相比例主峰峰形變寬，降低有機相比例主峰峰形不佳且分離度下降；向流動相中加入磷酸鹽后可明顯改善主峰拖尾現(xiàn)象，可能是因為磷酸鹽對色譜柱的羥基有改性作用并且可以調(diào)節(jié)流動相的pH值使M-2與其有關(guān)物質(zhì)分離度提高；另因為溶解性效應(yīng)M-2峰形有前沿現(xiàn)象，向配樣溶液甲醇中加入20%的水可以有效改善主峰前沿。因此M-2流動相選用甲醇-50 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（60∶40），配樣溶液選用甲醇-水（80∶20）。中間體L-1的流動相甲醇-水比例為85∶15時主峰與其有關(guān)物質(zhì)能有效分離且峰形較好，若減少有機相比例則主峰峰形變寬且與有關(guān)物質(zhì)的分離度降低，故L-1流動相選用甲醇-水（85∶15），配樣溶液選用甲醇。

本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀鈣3種中間體FPAP、M-2和L-1的含量測定方法和有關(guān)物質(zhì)檢查方法，結(jié)果表明所建立的方法簡單、準確、重復(fù)性好，可用于阿托伐他汀鈣3種中間體的質(zhì)量控制?？刂坪?種中間體的質(zhì)量是確保阿托伐他汀鈣有關(guān)物質(zhì)含量低和產(chǎn)品純度高的必要前提。本研究對于阿托伐他汀鈣原料藥生產(chǎn)過程的控制具有較重要的意義。

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