胡文杰，高捍東，江香梅

(1.南京林業(yè)大學 森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037;2.江西省林業(yè)科學院 國家林業(yè)局樟樹工程技術研究中心，江西 南昌 330032)

樟樹(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)屬樟科樟屬樹種，為我國二級保護植物。樟樹材質優(yōu)良，是江南四大名木之一;樹體偉麗多姿，樹冠寬大，四季常青，是我國南方園林景觀綠化美化和生態(tài)環(huán)境建設使用最多的樹種;根、莖、枝、葉富含精油，其精油的主要化學成分有芳樟醇、樟腦、黃樟油素、桉葉油素、異橙花叔醇、龍腦、松油醇、a－蒎烯、莰烯、丁香酚和香葉醇等，是我國用量最大的傳統(tǒng)天然香料之一，也是重要有效藥用成分[1－2]，被廣泛應用于香精香料、醫(yī)藥、化工、食品和煙草等工業(yè);種子中富含中碳鏈脂肪酸，是功能性油脂、生物能源等的重要原料。因此，樟樹是一種集材用、藥用、香精香料、油用、風景園林等一體的多用途林木資源，被譽為江南寶樹[3]，具有巨大開發(fā)利用價值。

有關樟樹枝葉精油提取方法較多，主要有水蒸汽蒸餾法[4]、氣體吸附法[5]、溶劑浸提法[6]、超臨界CO2萃取法[7]等。水蒸氣蒸餾法是使用最多的提取方法，主要原因是提取設備簡單，容易操作，成本低，提取溶劑為水，對環(huán)境友好，無三廢排放，因此備受青睞。本文旨在對影響水蒸氣蒸餾法提取樟樹葉精油提取率的3個主要因素提取時間、水料比、提取功率，在單因素試驗基礎上，進一步利用3因素3水平的響應面分析方法進行優(yōu)化試驗，再采用回歸分析方法對其相互關系通過擬合得到回歸方程，優(yōu)化出最佳工藝參數，為提高樟樹葉精油提取率和質量提供優(yōu)化工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在江西省林業(yè)科學院內，選擇樟樹中油樟化學類型的10棵植株作為樣株，分別2次采集葉樣:一是于2012年2月下旬、自然落葉前采集，這一時期的葉片代表生理老葉，葉片中精油含量相對較低;二是于5月下旬、葉面積和葉重增加基本穩(wěn)定時采集，這一時期的葉片代表生理新葉，葉片中精油含量相對較高。因為這兩個時期葉的精油含量差別很大。每次采樣時，每棵植株稱取200 g新鮮葉樣充分混勻后，作為試驗用葉樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉精油水蒸汽蒸餾法 在自制水蒸汽蒸餾器中加入適量沸水和新鮮樟樹葉，加熱蒸餾，蒸餾時產生的共沸蒸汽經冷凝管冷凝后滴入水分離器而分為兩相，水相在下層。上層的精油經水分離器的旋塞放出，稱重，計算其精油提取率。

1.2.2 試驗設計方法 (1)單因素試驗設計。對影響樟樹葉精油提取率的3個關鍵因素提取時間、水料比、提取功率分別進行單因素試驗，初步篩選出各試驗因素中的優(yōu)化水平。各因素各水平試驗設計見表1。

表1 單因素試驗設計Tab.1 The single factor experiment design

(2)響應面優(yōu)化試驗設計。以各因素單因素優(yōu)化試驗結果為基礎，以樟樹葉精油提取率為響應值，進一步進行3因素3水平的響應面法試驗[8－9]。設計時，兩次提取試驗的因素不變，試驗水平則略有差異，詳情見表2。根據方程 Xi=(xi－x0)/Δx對自變量進行編碼(Xi為自變量的編碼值，xi為自變量的真實值，x0為試驗中心點處自變量的真實值，Δx為自變量的變化步長)，i=1，2，3。

表2 兩次試樣響應面法試驗因素與水平設計Tab.2 Factors and levels of response surface methodology for two times

1.2.3 樟樹葉精油提取率計算 精油提取率(%)=(精油重/鮮葉重)×100%

1.2.4 優(yōu)化工藝驗證 以單因素試驗、響應面優(yōu)化試驗確定的最佳工藝和修正后的響應面最佳工藝條件，分別進行葉精油提取試驗，比較葉精油提取率，驗證優(yōu)化工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對精油提取率的影響 由圖1可知，兩次試樣提取結果均表明:樟樹葉精油提取率隨提取時間由40 min增加到60 min時，精油提取率顯著提高，2月試樣由0.502%提高到1.334%，5月試樣由1.143%提高到2.051%。然而隨著提取時間的進一步增加，精油提取率增加緩慢，最后基本穩(wěn)定在一個恒定值上。這是因為隨著提取時間的延長，原料葉中的精油逐漸被提取完，即使進一步延長提取時間，提取率也不再增加。兩次試樣提取結果的變化趨勢完全一致。綜合考慮能耗、生產成本等方面的因素，認為60 min為適宜提取時間。

圖1 提取時間對提取率的影響Fig.1 Effects of extracting time on the extracting rate

圖2 水料比對提取率的影響Fig.2 Effects of water to material ratio on the extracting rate

2.1.2 水料比對精油提取率的影響 由圖2可知，隨著水料比的增加，精油提取率呈先快速提高后穩(wěn)定在一個值上的變化趨勢。在水料比由7.5∶1增加到12.5∶1時，提取率顯著增加，2月試樣由0.691%提高到1.322%，5月試樣由1.197%提高到2.050%，接近于最大值;當水料比繼續(xù)增加到15.0∶1以上時，提取率基本不再提高，兩次提取試驗結果完全一致。這是因為水料比也是精油提取過程中一個重要的影響因素。水料比過低，水散作用進行得不徹底，必將影響出油率;而水料比過高，又會導致精油在水中的溶解度增大，從而使精油得率降低[10]。同時能耗也隨之增加，造成能源的浪費。綜合能耗和提取得率兩方面因素，認為水料比以12.5∶1為佳。

2.1.3 提取功率對精油提取率的影響由圖3可知，精油提取率隨提取功率呈先快速增加再趨于穩(wěn)定的變化趨勢。提取功率由400 W增加到1 200 W時，精油提取率接近于最大值，2月試樣為1.377%，5月試樣為2.127%;提取功率繼續(xù)增加，精油提取率則基本不再提高。兩次提取試驗結果完全一致。故選擇1 200 W為最佳提取功率。

圖3 提取功率對提取率的影響Fig.3 Effects of extracting power on the extracting rate

2.2 響應面分析法優(yōu)化樟樹葉精油的提取工藝

2.2.1 響應面試驗測定結果與分析 以單因素試驗篩選的優(yōu)化水平為基礎，進一步進行3因素3水平共15個試驗點的響應面試驗，其中第1～12試驗點為析因試驗點，13～15試驗點為中心試驗點，用來估計試驗誤差。

采用Design Expert 8.05 b等軟件對所得數據進行ANOVA分析，分析結果(表3)表明，兩次試樣提取率最高的試驗處理均在試驗4號為最高，2月試樣的提取率為1.378%，5月試樣的提取率為2.135%。

表3 響應面試驗方案及結果Tab.3 Experiment design and results of response surface methodology

通過擬合，得到兩次試樣精油提取率響應面的兩個二次多元回歸方程為:

對上述兩個回歸模型自變量和應變量之間的線性關系進行方差分析，結果見表4。由表4可知，兩個回歸模型均達到極顯著水平，說明上述回歸模型中，各因素與響應值之間的線性關系是合理可行的。兩個模型中預測值與試驗值之間的相關系數分別為R2=0.9791和R2=0.9780，說明兩次提取試驗提取率的試驗值與預測值之間有較好的擬合度。

兩次試驗回歸模型中各項因子的方差檢驗結果(表4)還表明，在一次項因子中，達到極顯著水平的因子為X1，達到顯著水平的因子為X3，X2的差異未達到顯著水平。在二次項因素中，X12的影響達到顯著水平，X22和X32均達到極顯著水平;而在3對交互作用項中，僅X1X2項的影響達到顯著水平，其它項不顯著。

表4 回歸方程的方差分析及其系數的顯著性檢驗Tab.4 Analysis of variance for the fitted quadratic equation and significance test of the regression coefficients

2.2.2 交互作用項等高線圖和響應面分析 在響應面分析法中，通常用響應面圖和等高線的形狀來直觀地反映兩個因素交互效應的大小。圓形表示交互作用不顯著，橢圓形則表示交互作用顯著。

(1)提取時間與水料比交互項對提取率的影響。由圖4和圖5可知，無論是2月試樣還是5月試樣，提取時間與水料比的交互作用的響應面圖和等高線均呈橢圓形，說明其交互作用達顯著水平。且等高線沿時間軸方向變化相對密集，說明提取時間對精油提取率的影響比水料比大。這與單因素項的試驗結果一致。

圖4 Y=f(X1，X2)的響應面圖和等高線圖(2月下旬)Fig.4 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X1，X2)(Late February)

(2)提取時間與提取功率交互項對提取率的影響。由圖6和圖7可知，提取時間與提取功率的交互作用雖然在統(tǒng)計意義上未達到顯著水平，但其等高線還是呈較典型的橢圓形，達到較顯著水平。此外，沿時間軸方向的等高線密度變化明顯高于提取功率方向的變化。說明提取時間對樟樹葉精油提取率的影響要大于提取功率。

圖5 Y=f(X1，X2)的響應面圖和等高線圖(5月下旬)Fig.5 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X1，X2)(Late May)

圖6 Y=f(X1，X3)的響應面圖和等高線圖(2月下旬)Fig.6 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X1，X3)(Late February)

圖7 Y=f(X1，X2)的響應面圖和等高線圖(5月下旬)Fig.7 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X1，X3)(Late May)

(3)水料比與提取功率交互項對提取率的影響。由圖8和圖9可知，水料比與提取功率的等高線接近圓形，說明其交互作用不顯著。但等高線密度沿水料比軸方向略大于提取功率方向，說明水料比對精油提取率的影響要大于提取功率。

2.2.3 驗證性試驗 采用Design－Expert 8.5 b軟件分析兩次試驗測試結果，可得出最大響應值(Y)時對應的編碼值。其中:2月試樣的結果為:X1=1，X2=0.33，X3=0.23;根據編碼值與非編碼值的轉換式解得響應面法對樟樹葉精油提取條件的最佳工藝條件為:提取時間(x1)=70 min，水料比(x2)=13.325∶1，提取功率(x3)=1 292 W。在此工藝條件下，其最大精油提取率理論值為1.453%。

圖8 Y=f(X2，X3)的響應面圖和等高線圖(2月下旬)Fig.8 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X2，X3)(Late February)

圖9 Y=f(X2，X3)的響應面圖和等高線圖(5月下旬)Fig.9 Responses surface plot and contour plot of Y=f(X2，X3)(Late May)

5月試樣的結果為X1=1.00，X2=－0.01，X3=－0.06;根據編碼值與非編碼值的轉換式解得響應面法對樟樹葉精油提取條件的最佳工藝條件為:提取時間(x1)=65 min，水料比(x2)=12.495∶1，提取功率(x3)=1 194 W。在此工藝條件下，其最大精油提取率理論值為2.151%。

為了驗證響應面法的可行性和可靠性，采用以上兩次試驗研究篩選的最佳提取工藝條件，分別于2月和5月兩次采集樟樹葉樣，每次采集的葉樣均進行5次重復提取試驗。最后得出，兩次試樣平均提取率分別為1.427%和2.139%，與理論值的相對誤差分別為1.79%和0.56%。兩次試驗的驗證值與回歸方程的理論預測值吻合得很好。因此，響應面法對樟樹葉精油提取條件的優(yōu)化是合理可行的。

3 結論與討論

3.1 取樣時間對精油含量的影響

樟樹各部位都含精油，因樹齡、立地條件、樹體部位和采集季節(jié)不同，其含量存在較大差異[11]。因此，本試驗于2月下旬和5月下旬分別采集樟樹葉樣進行葉精油的提取試驗，其原因是樟樹一般于3月中下旬到4月上旬換葉，老葉脫落，新葉萌生。因此，2月取樣葉代表落葉前的老葉，而5月取樣葉代表葉面積和葉重量均達到最大的穩(wěn)定狀態(tài)的新葉。試驗結果表明，老葉和新葉中精油含量差別很大，前者僅為1.43%左右，而后者可達2.13%左右?？梢姡喜杉瘯r間是決定精油得率的關鍵因素。

3.2 基于響應面法的水蒸氣蒸餾法最佳提取工藝條件的確定

在原料最佳采集時間確定后，如何達到最佳提取效果，則需要確定最佳提取條件。本研究用2月試驗和5月試樣分別進行提取條件優(yōu)化試驗，獲得了兩個回歸模型和兩套最佳提取工藝條件。即:2月試樣的最佳提取工藝參數為:提取時間(x1)=70 min，水料比(x2)=13.325∶1，提取功率(x3)=1 292 W;5月試樣的最佳提取條件為:提取時間(x1)=65 min，水料比(x2)=12.495∶1，提取功率(x3)=1 194 W。這兩套優(yōu)化提取條件存在的差異，主要來源于如下兩個方面:一是老葉和新葉本身對提取條件的要求存在差異;二是5月試樣在試驗水平設計上與2月試樣略有不同，5月試樣提取時，是在總結2月試樣提取試驗經驗的基礎上，將3個因素的試驗水平在單因素試驗確定的最優(yōu)水平上，進一步縮小試驗水平梯度，達到更精細設計的目的。用5月試樣分別用兩套優(yōu)化提取條件進行5次重復提取試驗，結果表明:用2月試樣的優(yōu)化條件提取的平均提取率為2.145%;用5月試樣的優(yōu)化條件提取的平均提取率為2.139%。兩套方案的精油提取得率十分接近。但兩套提取方案的能耗卻存在較大差別，后者提取時間可縮短5 min，提取功率可降低98 W，水的用量也可以減少6%以上。因此，綜合考慮的結果，認為以5月試樣篩選的提取條件為佳。為實際操作時簡便起見，將優(yōu)化提取條件簡化為:提取時間65 min，水料比12.5∶1，提取功率 1 200 W。

3.3 響應面分析法在樟樹精油成分提取方面的應用效果

響應面分析法是通過中心組合試驗，同時研究多種試驗因素間交互作用的一種回歸分析方法，具有試驗次數少、周期短，求得的回歸方程精度高等優(yōu)點，并能通過圖形分析較直觀地尋求最優(yōu)試驗考察因素值[12]，克服了傳統(tǒng)數理統(tǒng)計方法數據量較大，無法考慮各因素綜合作用的缺點。本試驗結果表明，響應面分析法對樟樹葉精油提取條件優(yōu)化具有重要指導作用，在相關研究領域也將有廣闊的應用前景[13]。

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