丁愛軍，梁 穎，賈明良，2，覃佐東，2，張本厚，陳集雙，2*

(1.南京工業(yè)大學(xué) 大豐海洋產(chǎn)業(yè)研究院，江蘇 大豐 224100;2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京210009)

隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，能源的需求量日益增加且依存度不斷提高，導(dǎo)致地球上化石能源儲(chǔ)量日趨減少，為此尋找儲(chǔ)量豐富且環(huán)境友好的綠色生物質(zhì)能源代替化石能源將成為解決能源危機(jī)及可持續(xù)發(fā)展的途徑之一［1］。近20年來，由動(dòng)植物制備生物質(zhì)柴油作為石油燃料的替代物，已引起世界各國的廣泛關(guān)注。目前利用生物質(zhì)資源生產(chǎn)柴油技術(shù)已經(jīng)成熟，如玉米、植物秸桿、微藻及地溝油等。國內(nèi)外利用微藻如小球藻、螺旋藻、柵藻等進(jìn)行能源開發(fā)有相關(guān)研究，其中以小球藻的研究最多，它的光合作用效率是一般高等植物的10倍左右。小球藻以自養(yǎng)、異養(yǎng)、混合養(yǎng)等方式生長，目前已知的有十幾種，包括變種在內(nèi)，可達(dá)百種之多，具有分布廣泛，生長速度快，易于培養(yǎng)及富含脂肪等特點(diǎn)［2］。自20世紀(jì)50年代以來，研究人員開始用微藻進(jìn)行水處理研究，發(fā)現(xiàn)其具有降解水體有毒污染物、富集重金屬離子等能力［3］。污水養(yǎng)藻是一種成本低廉、操作方便，易推廣及有利于生態(tài)健康的技術(shù)，同時(shí)還可凈化水體，是一種對(duì)環(huán)境減害化處理的同時(shí)獲得有用能源物質(zhì)的較好方法。異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻可以克服自養(yǎng)培養(yǎng)的不足，是提高小球藻油脂含量的一條有效途徑。本實(shí)驗(yàn)利用周邊奶牛養(yǎng)殖場糞便作為材料，研究其浸出物對(duì)球藻生長和脂肪結(jié)累等影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藻種 本實(shí)驗(yàn)小球藻種于南京工業(yè)大學(xué)開放式小球藻培養(yǎng)池中獲取。

1.1.2 牛糞浸出培養(yǎng)基 牛糞取自上海光明集團(tuán)大豐海豐奶牛場種植田邊堆場，經(jīng)烘干除臭處理，按50 g/L加入蒸餾水中，攪拌20 min，稍加熱到80℃，400目過濾，靜置12 h，收集上清液備用。蒸餾水與牛糞浸出液體積比設(shè)定為:9∶1、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、1∶9，并用 1 mol/L HCl或 NaOH 調(diào) pH 為 6.5 ～6.8，設(shè)陽性BG11及陰性蒸餾水為對(duì)照組，培養(yǎng)基經(jīng)121℃高溫高壓滅菌處理20 min。

1.1.3 主要儀器 BOXUN醫(yī)用型超凈臺(tái);L96G PCR儀、電泳系統(tǒng)及BioMate3S雙光束紫外光/可見光光譜儀;美國Syngene凝膠成像系統(tǒng);光學(xué)顯微鏡;UB-7 pH計(jì);SIGMA臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);XB-70制冰機(jī)及微量加樣器等。

1.1.4 主要試劑 配制 BG11培養(yǎng)基試劑為 KNO3、K2HPO4、Ca(NO3)2、MgSO4、KCl、FeCl3、H3BO4、Zn-SO4·7H2O、MnSO4·H2O、(NH4)6MoO2·4H2O、CuSO4·5H2O 等，PCR 試劑為 DNA Marker、Taq 酶及MBI PCR產(chǎn)物純化試劑盒;DNA及油脂提取試劑為丙酮、異丙醇、苯酚及甲醇等。

1.2 方法

1.2.1 球藻培養(yǎng) 采集的藻種用BG11培養(yǎng)液稀釋后涂BG11固體平板，在25℃、光照周期為12 h:12 h、3 000 lx冷白熒光燈條件下培養(yǎng)。挑取單藻落平板上反復(fù)劃線分離;將藻接種到含1 mL BG11培養(yǎng)基的PE管，同等條件培養(yǎng)20 d，鏡檢確認(rèn);接種至50 mL BG11中，每天定時(shí)搖動(dòng)，OD680達(dá)0.3以上，取10 mL用于藻種鑒定;按牛糞浸出液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，每實(shí)驗(yàn)組接種1 mL藻種，培養(yǎng)4周，每周取樣3 mL，用于生長量測定，剩余用于藻類油脂提取。

1.2.2 18S rDNA序列分析 采用18S rDNA鑒定的方法確定經(jīng)分離純化球藻的種屬。總DNA的提取采用CTAB法，Invitrogen公司提供并合成的PCR擴(kuò)增上下浮引物，分別為18S－F:5'GCGCGGCTCATTAAATCAGTTATAG3'18S－R:5'，CCCTTGTTACGATTTCTCCTTCCTC3'，PCR 反應(yīng)條件為 94℃ 變性3 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物再進(jìn)行純化并測序。18S rDNA序列在GenBank進(jìn)行BLAST序列比對(duì)對(duì)藻種鑒定。

1.2.3 球藻及牛糞浸出液吸光度掃描 取1.5 mL藻液3 500 r/min、5 min離心，棄上清液，在沉淀中加入2.5 mL丙酮充分溶解，提取球藻中葉綠素，在BioMate 3S雙光束紫外光/可見光光譜儀上掃描其在300～800 nm吸光值，確定球藻生長量測量時(shí)所采用的波長。牛糞浸出液用蒸餾水作基線，將其按1∶9稀釋，在200～900 nm內(nèi)進(jìn)行掃描，確定其波長。

1.2.4 球藻生長速率測定 根據(jù)掃描結(jié)果，確定小球藻葉綠素有2個(gè)吸收峰，分別為波長660 nm和430 nm。每周收集1次樣品，測定其在2個(gè)波長的吸光值，根據(jù)公式統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組葉綠素A、葉綠素B及葉綠素總量的日均增長率等，球藻總?cè)~綠素值 =OD660×8.02+OD430×20.21［4］。

1.2.5 球藻油脂提取 收集等量藻液，5 000 r/min、3 min離心，再用ddH2O洗滌2次，離心烘干稱重;經(jīng)兩次－20℃ ～40℃凍融，加入5 mL的氯仿∶甲醇 (1∶2)溶劑萃取充分，加石油醚3 mL，60℃水浴60 min，離心過濾，水浴蒸發(fā)，105℃烘干冷卻后稱重，每組重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 18S rDNA 序列分析

經(jīng)純化后采用CATB法提取小球藻全基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量合格(圖1);利用基因組 DNA及上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，18S rDNA基因片段約為1.7 kb(圖2);經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，并送上海生工進(jìn)行測序，通過雙向測序，利用軟件進(jìn)行序列拼接，最終獲得長度約為1.7 kb的球藻18S rDNA基因序列。通過BLAST程序獲得NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫18S rRNA基因與球藻相近的序列，確定比對(duì)結(jié)果，證明該小球藻屬于普通小球藻株。

圖1 小球藻基因組DNAFig.1 Chlorella vulgaris genome DNA

圖2 小球藻18S rDNA PCR產(chǎn)物Fig.2 Chlorella vulgaris 18S rDNA PCR product

2.2 牛糞浸出液培養(yǎng)球藻生長率測定

2.2.1 球藻和牛糞浸出液吸光度掃描 用丙酮提取的小球藻葉綠素在雙光束光度儀上波長掃描，發(fā)現(xiàn)球藻葉綠素在可見光范圍內(nèi)有2個(gè)明顯吸收峰，分別在660 nm和430 nm(圖3)，根據(jù)掃描結(jié)果可以用660 nm和430 nm作為葉綠素吸光度的測定波長。利用蒸餾水為空白作基線，牛糞浸出液經(jīng)掃描吸收峰位于200～350 nm，400～900 nm其峰值明顯降低，接近于0(圖4)，可知，牛糞浸出液培養(yǎng)球藻利用雙光束光度儀測定葉綠素吸光值不受干擾，且數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

圖3 球藻葉綠素光譜掃描Fig.3 Spectral scan on chlorophyll of Chlorella vulgaris

圖4 牛糞浸出液光譜掃描Fig.4 Spectral scan on extracts from cow dung

2.2.2 球藻培養(yǎng)生長率測定 利用牛糞浸出液培養(yǎng)球藻，共設(shè)6個(gè)試驗(yàn)組，2個(gè)對(duì)照組，每周取樣1次，共取4次，利用雙光束光度儀在660 nm和430 nm 2個(gè)波長測定葉綠素吸光值，并分別記錄，根據(jù)公式計(jì)算球藻葉綠素總量，確定其生長率，結(jié)果見圖5。由此可見，利用牛糞浸出液進(jìn)行球藻養(yǎng)殖其生長速度高于BG11培養(yǎng)劑，且差異明顯，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高濃度牛糞浸出液抑制球藻生長，隨著其營養(yǎng)消耗濃度降低，球藻生長速度逐漸提高，這可能與球藻生長對(duì)有機(jī)物利用控制調(diào)節(jié)有關(guān)。球藻培養(yǎng)最適水與牛糞浸出液體積比為4∶6，培養(yǎng)周期為20 d左右。結(jié)果表明利用牛糞浸出液進(jìn)行藻類培養(yǎng)是可行的。

2.3 異養(yǎng)球藻油脂含量測定

每個(gè)試驗(yàn)組收集等量藻液，設(shè)3個(gè)平行組，經(jīng)洗滌、萃取及烘干等處理，稱重并記錄數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析，其結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，利用牛糞浸出液培養(yǎng)球藻油脂含量明顯高于BG11對(duì)照組，差異顯著(P ＜0.05);試驗(yàn)組(2∶8)、(1∶9)球藻后期生長量大，觀察呈絲狀而且相互粘在一起，可能導(dǎo)致萃取不充分，使得油脂提取得率下降;而試驗(yàn)組(9∶1)、(8∶2)和(6∶4)球藻后期生長未出現(xiàn)上述現(xiàn)象，萃取充分，其油脂得率逐步升高，達(dá)0.57以上。利用與BG11培養(yǎng)的球藻相比，觀察發(fā)現(xiàn)牛糞浸出液培養(yǎng)的球藻呈深綠色，可以說明牛糞浸出液能提高球藻油脂得率，研究發(fā)現(xiàn)最佳適合球藻培養(yǎng)體積比為4∶6。這可能與球藻吸附培養(yǎng)液的脂肪有關(guān)。

圖5 牛糞浸出液培養(yǎng)球藻生長率曲線Fig.5 Growth rate curve of Chlorella vulgaris cultured by extracts from cow dung

圖6 各試驗(yàn)組球藻提取油脂得率Fig.6 Lipid content graph extracted from Chlorella vulgaris in each test group

3 討論

微藻生物研究屬于生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重要分支，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。小球藻是人類最早分離培養(yǎng)的一種綠藻，其生態(tài)分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)且油脂含量較高，它的生長速度快，光合作用效率是一般高等植物的10倍左右。另外，小球藻在不同培養(yǎng)條件下可以產(chǎn)生10% ～30%細(xì)胞干重的脂類，可以用于轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲脂即生產(chǎn)生物柴油，是目前研究生產(chǎn)生物柴油的熱點(diǎn)藻種之一［5－6］。本實(shí)驗(yàn)藻種18S rDNA序列利用 BLAST程序分析表明球藻種18S rDNA基因序列與 Chlorella vulgaris sp.NIE21721最為接近，且僅有一個(gè)堿基替換，與另一種小球藻Chlorella vulgaris sp.CCAP260/11屬同一個(gè)分支，進(jìn)一步可以確證他們之間存在很近的親緣關(guān)系，從而可以確定實(shí)驗(yàn)藻種屬于普通小球藻。

自1953年Lewin等［7］首先發(fā)現(xiàn)了某些種類能利用有機(jī)物作為唯一碳源和能源進(jìn)行異養(yǎng)生長以來，受到科學(xué)界廣泛重視。有研究表明，小球藻在只有無機(jī)鹽、維生素以及光作用的條件下就能正常生長，且光合效率高。但無機(jī)鹽培育的小球藻，由于營養(yǎng)鹽迅速消耗以及各種影響因素的干擾，在生產(chǎn)中極不穩(wěn)定。近年諸多研究者對(duì)小球藻異養(yǎng)的研究開始關(guān)注，當(dāng)在培養(yǎng)液或培養(yǎng)基中含有葡萄糖等有機(jī)碳源時(shí)，小球藻的營養(yǎng)方式可以由自養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)楫愷B(yǎng)。高密度培養(yǎng)方式可以使小球藻的生長速度、密度細(xì)胞大幅度提高，而不受光限制［8］。異養(yǎng)條件下，小球藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量可達(dá)60%以上，可作為一種新型的油脂資源［1，9］。目前，國內(nèi)外對(duì)牛糞進(jìn)行了很多研究，證明牛糞具有廣泛的用途，如利用牛糞生產(chǎn)再生飼料、生產(chǎn)沼氣、發(fā)電及在木屑栽培平菇中的應(yīng)用等［10］。對(duì)實(shí)驗(yàn)原料牛糞進(jìn)行的生化分析和研究中得出，在新鮮牛糞便中，水占83.2% ～83.36%，有機(jī)物占8.44% ～10.62%，灰分占5.2% ～6.18%，其中有機(jī)物成分主要為未消化的纖維素和蛋白質(zhì)(水溶性蛋白質(zhì)含量1.17% ～1.23%)等，pH值為7.5［11］。牛糞還有另外一些用途，其浸出液敷于小白鼠傷口，可促進(jìn)其愈合效果［10］。可探索利用牛糞為材料及發(fā)酵工程的方法大規(guī)模地生產(chǎn)微藻，為微藻內(nèi)含物、生長及吸附等機(jī)理的研究提供基礎(chǔ)平臺(tái)。

大多數(shù)產(chǎn)油微藻的油脂組成與油料植物相似，脂肪酸多以C16和C18為主［12］，且多為飽和和單不飽和脂肪酸，小球藻也不例外［13］。本實(shí)驗(yàn)利用牛糞浸出物培養(yǎng)球藻油脂得率高于BG11培養(yǎng)方式，可能是浸出物中多糖、脂類等經(jīng)過次生代謝將脂類物質(zhì)貯藏于液泡或細(xì)胞壁中，或通過吸附功能［14］將浸出液中的脂肪吸附細(xì)胞表面，也可能是缺N等環(huán)境脅迫等因素［15］，從而提高油脂含量，相關(guān)機(jī)理研究需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究中主要優(yōu)化了牛糞浸出液培養(yǎng)微藻系統(tǒng)和產(chǎn)油率方面的關(guān)系，進(jìn)一步可對(duì)牛糞浸出物中的有機(jī)物及N、P成分的含量進(jìn)行測定，同時(shí)分析球藻脂肪組成，以探討球藻脂肪生成代謝調(diào)控，為提高球藻產(chǎn)油提供有力證據(jù)。

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