牛 科，單 思，巴彩鳳

遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001

星狀病毒(astroviruses)是一種主要引起人和動(dòng)物以腹瀉癥狀為主的急性病毒性胃腸炎的單股正鏈RNA病毒[1]。人星狀病毒(human astroviruses，HAstV)主要感染5歲以下嬰幼兒、免疫抑制人群及老年人。1975年，Appleton和Higgins電鏡檢測(cè)兒童腹瀉糞便標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)HAstV。其基因全長(zhǎng)6.4~7.3 kb，包括5'端非編碼區(qū)和3'端的polyA結(jié)構(gòu)，基因組中含三個(gè)ORF1a、ORF1b和ORF2開(kāi)放閱讀框。ORF1a和ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白-衣殼蛋白(capsid protein)。因ORF2區(qū)是變異相對(duì)較高的區(qū)域，通過(guò)對(duì)ORF2的5'端基因序列分析將HAstV分為8個(gè)傳統(tǒng)的血清型(HAstV1-8)[2]。另外，美國(guó)學(xué)者利用宏基因組技術(shù)分離到HAstVMLB型、 VA型、 HMOASTV型3種新的病毒亞型[3-7]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用生物信息軟件及互聯(lián)網(wǎng)在線(xiàn)數(shù)據(jù)分析工具對(duì)HAstV1衣殼蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等空間結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、消光系數(shù)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)等理化參數(shù)及親水性、柔韌性、抗原指數(shù)及表面可及性等生物學(xué)特性，為進(jìn)一步完善星狀病毒基礎(chǔ)研究和臨床研究資料提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

材料和方法

1 基因序列 HAstV1衣殼蛋白GeneBank序列號(hào)：L23513，因特網(wǎng)(Internet)鏈接網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L23513。

2 蛋白理化參數(shù)分析 通過(guò)ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)中的ProtParam軟件分析HAstV1衣殼蛋白的分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均疏水性。

3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與生物學(xué)特性分析 通過(guò)DNAStar軟件程序中的Editseq軟件將HAstV1衣殼蛋白中的基因序列翻譯成氨基酸序列，與GeneBank中的氨基酸序列校對(duì)，通過(guò)Protean模塊分析和預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)特性。鏈接網(wǎng)址：http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input。應(yīng)用immune epitope軟件中Kolaskar-Tongaonkar法預(yù)測(cè)HAstV1衣殼蛋白平均抗原指數(shù)。

4 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)在線(xiàn)數(shù)據(jù)分析工具Swiss-Model Workspace蛋白分析軟件預(yù)測(cè)HAstV1衣殼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。然后，應(yīng)用Swiss-pdb Wiewer軟件模擬蛋白的3D結(jié)構(gòu)。

結(jié) 果

1 HAstV1衣殼蛋白氨基酸序列 翻譯后的氨基酸序列與GeneBank中一致。序列如下：MASKSNKQVTVEVSNNGRNRSKSRARSQSRGRDKSV KITVNSRNRARRQPGRDKRQSSQRVRNIVNKQLRKQ GVTGPKPAICQRATATLGTVGSNTSGTTEIEACILLNP VLVKDATGSTQFGPVQALGAQYSMWKLKYLNVKLT SMVGASAVNGTVLRVSLNPTSTPSSTSWSGLGARKH LDVTVGKNATFKLKPSDLGGPRDGWWLTNTNDNAS DTLGPSIEIHTLGRTMSSYKNEQFTGGLFLVELASEW CFTGYAANPNLVNLVKSTDNQVPVTFEGSAGSPLIMN VSEGSHFARTVLARSTTPTTLARAGERTTSDTVWQV LNTAVSAAELVTPPPFNWLVKGGWWFVKLIAGRTR TGSRSFYVYPSYQDALSNKPALCTGSTPGGMRTRNP VTTTLQFTQMNQPSLGHGEAPAAIGRSIPAPGEEYKV VLTFGSPMSPNANNKQTWVNKPLDAPSGHYNVKIAK DVDHYLTMQGFTSIASVDWYTIDFQPSEAPAPIKGLQ VLVNISKKADVYAVKQFVTAQTNNKHQVTSLFLVKV TTGFQVNNYLSYFYRASATGDATTNLLVRGDTYTAG ISFTQGGWYLLTNTSIVDGAMPPGWVWNNVELKTNT AYHMDKGLVHLIMPLPESTQMCYEMLTSIPRSRASG HGYESDNIEYLDAPDSADQFKEDIETDTDIESTEDED DEADRFDIIDTSDEEDGNETDRVTLLSTLVNQGMTMT RATRIARRAFPTLSDRIKRGVYMDLLVSGVSPGNAW SHACEEARKAVGETNPCTSGSRGHAE。

2 理化參數(shù)分析 通過(guò)ProtParam軟件分析，HAstV1衣殼蛋白序列編碼787個(gè)氨基酸；分子質(zhì)量為85 772.2；理論等電點(diǎn)為9.00；在構(gòu)成HAstV1衣殼蛋白的20種氨基酸中，蘇氨酸(Thr)和甘氨酸(Gly)占的比例最高，分別為10.3%和7.9%，其含72個(gè)負(fù)電荷氨基酸(AsP+Glu)， 82個(gè)正電荷氨基酸(Arg+Lys)；HAstV1衣殼蛋白的半衰期哺乳動(dòng)物網(wǎng)組系統(tǒng)-體外為30 h，酵母-體內(nèi)＞20 h，大腸桿菌-體內(nèi)＞10 h；且其不穩(wěn)定系數(shù)為38.50，屬于穩(wěn)定性蛋白；脂肪系數(shù)為71.86；總平均疏水性為-0.435。

3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與生物學(xué)特性分析 利用DNAStar-Protean軟件分析得到HAstV1衣殼蛋白具有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)，含有較多的α螺旋和β折疊等穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，及豐富的β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲等韌性結(jié)構(gòu)，且親水性區(qū)段、柔韌性區(qū)段、抗原指數(shù)較高及表面可及性大的區(qū)段分布亦較多(圖1)。通過(guò)immune epitope軟件中Kolaskar-Tongaonkar法預(yù)測(cè)HAstV1衣殼蛋白平均抗原指數(shù)為1.013，最大值為1.194，最小值為0.848，見(jiàn)圖2。

4 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Swiss-Model Workspace應(yīng)用PDB序列號(hào)3qsq為模板預(yù)測(cè)HAstV1衣殼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖3)；并采用Swiss-pdbViewer蛋白質(zhì)分析軟件模擬HAstV1衣殼蛋白的分子表面模型(圖4)。由圖可知，HAstV1衣殼蛋白由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)組成規(guī)則的空間構(gòu)象。該構(gòu)象有7個(gè)由疏水氨基酸構(gòu)成的α-螺旋區(qū)域，位于蛋白的內(nèi)部；以8個(gè)疏水性殘基為主的β-折疊處于蛋白的中心，兩者共同構(gòu)成一個(gè)疏水核心區(qū)域；β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等柔韌性結(jié)構(gòu)位于蛋白的外部，它們結(jié)構(gòu)比較松散，易扭曲變形。

圖2 HAstV1衣殼蛋白的抗原表位指數(shù)分析Fig.2 Antigenic epitope index for HAstV1 capsid protein

圖3 HAstV1衣殼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of HAstV1 capsid protein

圖4 HAstV1衣殼蛋白分子表面模型Fig.4 Molecule surface of HAstV1 capsid protein

討 論

隨著信息時(shí)代的到來(lái)，生物信息學(xué)得到發(fā)展和廣泛應(yīng)用。通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件模擬和程序預(yù)測(cè)出各種核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化參數(shù)及生物學(xué)特性等信息或提供與之相關(guān)的輔助信息，從而用較低的成本和較快的時(shí)間獲得可靠的結(jié)果，大大的提高了實(shí)驗(yàn)效率[8]。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)理論分析HAstv1衣殼蛋白的理化參數(shù)與分子生物學(xué)特征發(fā)現(xiàn)，HAstv1衣殼蛋白是結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定蛋白且具有很好的抗原性，可以作為免疫用抗原，對(duì)進(jìn)一步研究HAstV1檢測(cè)方法、病毒侵襲力、毒力以及病毒起源都具有非常重要的意義。該蛋白是研究HAstv1抗原性、生化特性、結(jié)構(gòu)功能的理想工具，可應(yīng)用于HAstv1的免疫診斷和疫苗研制中。

1 Strain E， Kelley LA， Schultz-Cherry S， et al. Genomic analysis of closely related astroviruses［J］. J Virol， 2008， 82（10）： 5099-5103.

2 王永霞，段招軍，李宇寧．人星狀病毒研究進(jìn)展［J］.病毒學(xué)報(bào)，2012，28（4）：482-487．

3 Finkbeiner SR， Holtz LR， Jiang Y， et al. Human stool contains a previously unrecognized diversity of novel astroviruses［J］. Virol J，2009， 6：161.

4 Finkbeiner SR， Li Y， Ruone S， et al. Identification of a novel astrovirus （astrovirus VA1） associated with an outbreak of acute gastroenteritis［J］. J Virol， 2009， 83（20）： 10836-10839.

5 De Benedictis P， Schultz-Cherry S， Burnham A， et al. Astrovirus infections in humans and animals - molecular biology， genetic diversity， and interspecies transmissions［J］. Infect Genet Evol，2011， 11（7）： 1529-1544.

6 Kapoor A， Li L， Victoria J， et al. Multiple novel astrovirus species in human stool［J］. J Gen Virol， 2009， 90（Pt 12）： 2965-2972.

7 Jeong AY， Jeong HS， Jo MY， et al. Molecular epidemiology and genetic diversity of human astrovirus in South Korea from 2002 to 2007［J］. Clin Microbiol Infect， 2011， 17（3）： 404-408.

8 Rubinstein ND， Mayrose I， Halperin D， et al. Computational characterization of B-cell epitopes［J］. Mol Immunol， 2008， 45（12）：3477-3489.