于海英，焦金菊

遼寧醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，遼寧錦州 121000

糖尿病晚期患者多數(shù)伴有多器官并發(fā)癥，成為致死的主要因素。研究表明氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)氧化應(yīng)激及抗氧化能力減弱是糖尿病并發(fā)癥的主要病因[1]。應(yīng)用抗氧化治療可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對(duì)組織的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesterase inhibitors，PDEIs)臨床主要用于治療呼吸道痙攣、舒張血管平滑肌、增強(qiáng)心肌收縮力等[2]。最近有報(bào)道稱PDEIs具有抗氧化作用[3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用米力農(nóng)，昔多芬，茶堿3種PDEIs治療由鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型，探討3種PDEIs對(duì)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激的影響及保護(hù)作用，為糖尿病及其并發(fā)癥的藥物治療提供新的思路。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 健康成年SD(sprague dawley)雄性大鼠30只，體質(zhì)量180~220 g，遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)為Sigma公司產(chǎn)品；米力農(nóng)為山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；茶堿為湖北武漢藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；昔多芬為嘉興宜博生物醫(yī)藥科技有限公司出品；丙二醛、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。血糖檢測(cè)儀為美國(guó)強(qiáng)生公司onetouch。

2 糖尿病大鼠模型建立 將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予12 h -12 h光照-黑暗周期(6：00 ~18：00)。造模組腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg，(STZ溶于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液中，pH值為4.4)，對(duì)照組腹腔注射等量0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液，36 h后由尾靜脈取血測(cè)空腹血糖，血糖＞16.7 mmol/L且穩(wěn)定即可確認(rèn)糖尿病。造模過程中約有20%的死亡率，死亡的動(dòng)物由新動(dòng)物造模補(bǔ)充。

3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分5組，即非糖尿病對(duì)照組(未注射STZ)，將已成模的糖尿病大鼠隨機(jī)再分成4組，每組6只：糖尿病對(duì)照組；PIDEs組分別為米力農(nóng)組給予米力農(nóng)3.17 mg/(kg·d)，茶堿組給予茶堿 100 mg/(kg·d)，昔多芬組給予昔多芬 1 mg/(kg·d)。兩個(gè)對(duì)照組給予相同量的0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)15 d灌胃給藥。15 d后所有大鼠先取血液樣本，然后被處死。

4 血糖、體重測(cè)定 大鼠在治療前及治療后5 d、10 d和15 d稱體重，并尾靜脈抽取靜脈血滴在試紙上，采用血糖儀(onetouch)自動(dòng)讀取數(shù)值，記錄。

5 丙二醛檢測(cè) 將采集的血液樣本用肝素鈉抗凝，1 000 r/min離心10 min。收集上層血漿采用丙二醛(malondualdenyde，MDA)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA與硫代巴比妥酸結(jié)合，形成紅色產(chǎn)物，測(cè)在532 nm處最大吸收峰值。

6 總抗氧化能力測(cè)定 TAOC測(cè)定采用TAOC試劑盒用鐵還原法進(jìn)行測(cè)定[3]。

結(jié) 果

1 血糖、體重檢測(cè) 造模后大鼠活動(dòng)減少，精神萎靡。非糖尿病對(duì)照組血漿葡萄糖(5.1~5.4) mmol/L，實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)STZ誘導(dǎo)后血糖可達(dá)(21.8±0.8) mmol/L，表明糖尿病大鼠模型制備成功。三種PDEIs治療組血糖水平與糖尿病對(duì)照組治療前后比較血糖水平無明顯變化(表1)，說明PDEIs對(duì)于血糖無影響。而從體重方面看，非糖尿病組體重隨時(shí)間推移逐漸增加，其他組動(dòng)物體重隨著時(shí)間推移逐漸下降，各治療組動(dòng)物體重下降情況與糖尿病模型組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)，因而PDEIs也無調(diào)節(jié)體重作用。

2 體內(nèi)氧化應(yīng)激水平 非糖尿病對(duì)照組大鼠的TAOC和MDA與糖尿病對(duì)照組大鼠比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表2)。三種磷酸二酯酶抑制劑都顯著降低了血漿MDA水平，同時(shí)提高了TAOC水平(P＜0.01)，且對(duì)于TAOC的水平提高能力為米力農(nóng)＞昔多芬＞茶堿，表2。

表1 各組動(dòng)物體質(zhì)量，血糖值(n=6，

表1 各組動(dòng)物體質(zhì)量，血糖值(n=6，

aP＜0.01，與NDM組比較，bP＜0.05

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表2 血漿MDA, TAOC測(cè)量值(n=6，μmol/L)

表2 血漿MDA, TAOC測(cè)量值(n=6，μmol/L)

P＜0.01，與DM組比較

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討 論

糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要表現(xiàn)為糖代謝紊亂，后期常常出現(xiàn)多個(gè)器官的并發(fā)癥而給患者帶來嚴(yán)重后果。目前糖尿病并發(fā)癥的致病原因中，體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高是公認(rèn)的損傷機(jī)制。一些報(bào)道認(rèn)為抗氧化酶活性的減少導(dǎo)致了TAOC降低，如超氧化物歧化酶，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶[4]。臨床上抗氧化應(yīng)激的藥物有多種，如天然抗氧化劑維生素C，E等，但是研究報(bào)道這些藥物并不能減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率[5]。以往PDEIs主要作為強(qiáng)心、血管舒張、平滑肌舒張、抗哮喘、抗抑郁等藥應(yīng)用[6]。PDEIs的藥理作用主要是增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cydic adenosine monophosphate，cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平并促進(jìn)組織釋放NO[7]。最近研究報(bào)道PDEIs有提高機(jī)體抗氧化的能力，本實(shí)驗(yàn)分別選取米力農(nóng)(3型PDEIs)、茶堿(4型PDEIs)、昔多芬(5型PDEIs)治療糖尿病大鼠，在一定程度上降低了血漿MDA水平同時(shí)提高了總抗氧化能力。米力農(nóng)的抗氧化能力要比昔多芬和茶堿強(qiáng)，能顯著引起總抗氧化能力的提高并減少氧化應(yīng)激。這表明PDEIs由于抗氧化應(yīng)激效應(yīng)而對(duì)糖尿病具有保護(hù)性作用。研究表明氧化應(yīng)激引起的生物學(xué)反應(yīng)與脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物有關(guān)，能誘發(fā)包括G蛋白、cAMP、cGMP、蛋白激酶C、MAP級(jí)聯(lián)等多種致病的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙[8]。而我們發(fā)現(xiàn)PDEIs在抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用，可以對(duì)抗并逆轉(zhuǎn)由STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血漿氧化應(yīng)激水平。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PDEIs對(duì)于動(dòng)物的血糖和體重?zé)o調(diào)節(jié)作用，這說明其對(duì)糖尿病大鼠的保護(hù)作用不是通過降低葡萄糖濃度實(shí)現(xiàn)的。Bhatia等[9]報(bào)道NO在血管內(nèi)皮細(xì)胞通過cGMP和cAMP協(xié)同作用發(fā)揮抗氧化作用。他們認(rèn)為cAMP介導(dǎo)的NO保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制是通過cGMP依賴抑制cAMP分解實(shí)現(xiàn)的。此外還有報(bào)道NO能保護(hù)肺成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和腮腺免受氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷[10]。因此應(yīng)用PDEIs增加了環(huán)化核苷酸能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激引起的細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞凋亡。關(guān)于cAMP和cGMP磷酸二酯酶保護(hù)作用的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[11]。

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