佟玉娜，王高頻

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧錦州 121000

多年來(lái)，因?yàn)殡娮悠鸩鞯牟蛔闳缛狈?duì)神經(jīng)體液的自主調(diào)節(jié)等，構(gòu)建生物起搏器逐漸進(jìn)入人們的視野。目前超極化激活及環(huán)化核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道基因(HCN)具有起搏活動(dòng)所必須的獨(dú)特特征備受關(guān)注。研究表明HCN4在竇房結(jié)細(xì)胞起搏離子流中起著核心、特異性作用[1-2]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外培養(yǎng)擴(kuò)增快、易于外源基因的導(dǎo)入與表達(dá)，并具有多向分化潛能，可向成骨、成脂細(xì)胞等方向分化，成為理想基因治療的種子細(xì)胞[3-6]。由于HCN4是維持竇房結(jié)起搏細(xì)胞電生理功能的特異性基因，本研究則用攜帶hHCN4基因的重組腺病毒載體體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，通過(guò)RT-PCR和Western Blot方法檢測(cè)目的基因在BMSCs中有mRNA和蛋白水平的表達(dá)，證實(shí)hHCN4基因在BMSCs中能夠表達(dá)，為進(jìn)步證實(shí)攜帶hHCN4基因的BMSCs具有起搏功能提供依據(jù)，繼而將攜帶hHCN4基因的BMSCs作為生物起搏細(xì)胞，為基因和細(xì)胞相結(jié)合治療緩慢性心律失常構(gòu)建生物起搏器奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 200~250 g健康2個(gè)月大鼠10只(雌雄不拘)，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 主要試劑和儀器 重組腺病毒載體Ad-hHCN4-IRES/eGFP(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)；LipofectamineTM 2000(Invitrogen)；DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司)、胎牛血清(Hyclone公司)；Trizol RNA提取液(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)；RIPA(碧云天生物技術(shù)研究所)；大鼠抗人HCN4單克隆抗體(Abcam公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗大鼠IgG二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)。熒光顯微鏡(Olympus)、梯度PCR儀(Thermo)、Western Blot電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)、Labworks凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVP)。

3 BMSCs的分離、培養(yǎng)及傳代 取200~250 g健康2個(gè)月大鼠，斷頸處死，75%乙醇浸泡15 min，無(wú)菌條件下取大鼠股骨和脛骨，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗干凈，切除兩端干骺端，DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，2 000 r/min離心20 min，去除上清液，加含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于塑料培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下行原代培養(yǎng)(P0代)。3 d后更換培養(yǎng)液，換液前PBS沖洗2次，以去除未貼壁的造血細(xì)胞，加含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d換液一次，進(jìn)一步去除未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞匯合80%以上時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。培養(yǎng)至第3代(P3代)以上用于轉(zhuǎn)染并拍照。

4 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs 用已經(jīng)構(gòu)建成功的重組腺病毒載體Ad-hHCN4-IRES/eGFP體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs。轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM 2000試劑盒，取P3代生長(zhǎng)良好的BMSCs。用無(wú)抗生素的培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度為(0.5~2)×105。第2天，細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合。換液，加入2 ml不含抗生素的培養(yǎng)液。將4.0 μg質(zhì)粒pAV-hHCN4-IRES/eGFP用Opti-MEMⅠ培養(yǎng)液稀釋至50 μl，輕輕混勻；取10 μl LipofectamineTM 2000滴入40 μl的Opti-MEMⅠ培養(yǎng)液中，室溫孵育5 min。將稀釋的質(zhì)粒和稀釋的Lipofectamine TM 2000混合，輕輕混勻，室溫下孵育20 min。將此100 μl的混合液加入細(xì)胞孔中，37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5~6 h后，更換含血清的新鮮培養(yǎng)液。24~48 h后在熒光顯微鏡下依據(jù)綠色熒光判斷質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染至BMSCs中。

5 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞hHCN4基因mRNA的表達(dá) 將未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染Ad-hHCN4-IRES/eGFP 48 h后的BMSCs消化并離心收集，按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA產(chǎn)物為模板、β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR，所用引物見(jiàn)表1。hHCN4基因擴(kuò)增條件為94 ℃、45 s，63.6℃、45 s，72 ℃、1 min，共34個(gè)循環(huán)。β-actin擴(kuò)增條件為94 ℃、45 s，55.3 ℃、45 s，72 ℃、1 min，共 34 個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相并分析結(jié)果。

6 Western Blot檢測(cè)hHCN4基因蛋白的表達(dá)PBS沖洗細(xì)胞2遍，加入蛋白裂解液，冰上靜置30 min，然后將此混合液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，4 ℃、12 000 r/min×30 min離心，以RIPA蛋白提取試劑分別提取轉(zhuǎn)染Ad-hHCN4-IRES/eGFP后和未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的BMSCs的細(xì)胞總蛋白。一抗hHCN4和β-actin均按1∶1 000倍稀釋?zhuān)欢共捎美备^(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗大鼠IgG抗體，按1∶5 000倍稀釋。用ECL試劑盒顯色，有目的蛋白表達(dá)的條帶呈黑色，各條帶掃描后采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析。

表1 RT-PCR目的基因和對(duì)照基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of target and control genes for PCR

結(jié) 果

1 BMSCs形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 剛分離出的P0代細(xì)胞呈圓形，大小不等，細(xì)胞膜完整光滑，其中雜細(xì)胞較多；8~10 h后逐漸貼壁生長(zhǎng)，24 h后基本貼壁，48 h后多數(shù)為成纖維樣的梭形細(xì)胞；72 h后首次換液，大部分細(xì)胞已伸展呈多角形；7~10 d細(xì)胞集落逐漸增多并基本達(dá)90%以上融合；經(jīng)1∶2傳代后，造血細(xì)胞基本消失，貼壁細(xì)胞體積較大，生長(zhǎng)迅速，大多為長(zhǎng)梭型。P3代后細(xì)胞大小趨于均勻，以梭形細(xì)胞為主，部分小規(guī)則，細(xì)胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定。見(jiàn)圖1。

2 Ad-hHCN4-IRES/eGFP轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs 轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光(圖2)，根據(jù)綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率判斷腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率。有細(xì)胞綠色熒光表達(dá)說(shuō)明部分細(xì)胞已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)目的基因。調(diào)整轉(zhuǎn)染后細(xì)胞密度在(100~200)×105/L之間，0.25%胰酶消化，血球計(jì)數(shù)板普通視野下計(jì)細(xì)胞數(shù)A，換熒光下相同視野計(jì)熒光細(xì)胞數(shù)a，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率[轉(zhuǎn)染效率(%)=a/A×100%]。轉(zhuǎn)染24 h后轉(zhuǎn)染效率約為20%~30%。

3 轉(zhuǎn)染Ad-hHCN4-IRES/eGFP大鼠BMSCs hHCN4 mRNA檢測(cè) 轉(zhuǎn)染72 h后 提取BMSCs總RNA，用RT-PCR法檢測(cè)hHCN4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后BMSCs可檢測(cè)出hHCN4 mRNA，而未轉(zhuǎn)染的BMSCs未能檢測(cè)到hHCN4 mRNA，見(jiàn)圖3。

4 轉(zhuǎn)染Ad-hHCN4-IRES/eGFP大鼠BMSCs hHCN4蛋白表達(dá)Westem Blot檢測(cè) 結(jié)果顯示，Ad-hHCN4-IRES/eGFP轉(zhuǎn)染組BMSCs可檢出hHCN4蛋白表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染組的BMSCs未檢測(cè)到hHCN4蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖4。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs) A： P0代(×100)； B： 10 h后貼壁(×200)； C： P3代(×100)Fig.1 Bone marrow mesenchymal stem cells A： Primary generation; B： After 10 h adherent; C: Third-generation(×100)

圖2 轉(zhuǎn)染重組腺病毒的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)(×100)Fig.2 Expression of green fluorescence protein in rat bone marrow mesencyhmal stem cells after recombinant adenovirus transfection

圖3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后hHCN4-mRNA的表達(dá)Fig.3 RT-PCR showing expression of trans-fected hHCN4 mRNA M: DGL600 Marker； 1, 2: After trans-fection； 3, 4: Untransfected

圖4 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后hHCN4蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blot showing expression of transfected hHCN4 protein 1, 3: After transfection; 2, 4: Untran-sfected

討 論

Brown，Difrancesco[7]在竇房結(jié)起搏活動(dòng)中研究發(fā)現(xiàn)超級(jí)化激活環(huán)化核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道基因(hyperdarization activated cyclic nucleotide gated cation channed，HCN)具有超極化激活、鈉鉀離子通透、細(xì)胞內(nèi)cAMP調(diào)節(jié)、微弱的單通道電導(dǎo)及被細(xì)胞外銫特異性阻斷等特性，是起搏電流形成的分子基礎(chǔ)。HCN家族成員有4個(gè)，其中HCN1、HCN2及HCN4在心臟中表達(dá)。Xiao等[8]采用RTPCR法檢測(cè)竇房結(jié)和心房組織中HCNs的表達(dá)，結(jié)果示人竇房結(jié)組織中主要表達(dá)HCN4，占75%。心臟正常節(jié)律性跳動(dòng)有賴(lài)于竇房結(jié)正常發(fā)放沖動(dòng)以及完善的傳導(dǎo)系統(tǒng)。各種原因造成竇房結(jié)或房室結(jié)起搏細(xì)胞數(shù)量減少或功能衰退可進(jìn)一步導(dǎo)致嚴(yán)重的心動(dòng)過(guò)緩，引起竇房結(jié)功能障礙或房室傳導(dǎo)阻滯[9]。最新研究表明，HCN4的主要作用是使起搏的頻率維持在一定水平并隨著機(jī)體的不同生理狀態(tài)而對(duì)頻率進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]。因此，HCN4通道對(duì)竇房結(jié)潛在起搏活動(dòng)的產(chǎn)生有至關(guān)重要的作用，成為目前最受關(guān)注的起搏備選基因[11]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)存在于骨髓腔中，是一類(lèi)具有多項(xiàng)分化能力的干細(xì)胞，能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等中胚層細(xì)胞[12]。在其他一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)甚至臨床人體實(shí)驗(yàn)中，并沒(méi)有觀察到BMSCs明顯的致嚴(yán)重室性心律失常的事件發(fā)生，提示BMSCs用于心臟移植具有較大的安全性[13]。2005年Beeres等[14]體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，人BMSCs能修復(fù)心肌傳導(dǎo)阻滯。由于BMSCs具有較多優(yōu)點(diǎn)：1)易獲取、傳代，對(duì)人體無(wú)害，不存在法律及倫理問(wèn)題；2)免疫原性較低，不存在組織配型及免疫排斥問(wèn)題；3)易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)；4)具有多向分化潛能，已成為目前理想的基因治療靶細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)將攜帶hHCN4基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后的24~48 h觀察到部分BMSCs在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光顆粒，這說(shuō)明含綠色熒光蛋白的重組腺病毒載體已成功轉(zhuǎn)染到BMSCs中并正常表達(dá)，通過(guò)綠色熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和研究轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。更重要的是本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR及Western Blot檢測(cè)法從mRNA和蛋白水平的表達(dá)證實(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)染可使BMSCs表達(dá)hHCN4基因，進(jìn)一步證實(shí)基因和細(xì)胞可融洽的結(jié)合以構(gòu)建生物起搏器。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞聯(lián)合基因治療進(jìn)行了探索，取得了較為滿意的結(jié)果。轉(zhuǎn)染后BMSCs能夠表達(dá)hHCN4基因，但是攜帶hHCN4基因的BMSCs是否具有生理性起搏電流的特征？是否能與其共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞產(chǎn)生通訊功能？是否能夠替代因病變失去起搏功能的細(xì)胞或傳導(dǎo)系統(tǒng)？我們將進(jìn)行下一步研究，為構(gòu)建生物起搏器提供更多的基礎(chǔ)依據(jù)，以期該領(lǐng)域的研究成果早日應(yīng)用于臨床當(dāng)中。

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