王 勇，楊永濱，馬玉琛

1解放軍醫(yī)學(xué)院/解放軍總醫(yī)院 中醫(yī)研究所，北京 100853；2河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理教研室，河北保定 071000；3解放軍第252醫(yī)院 中醫(yī)康復(fù)科，河北保定 071000

肺間質(zhì)纖維化屬于間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)，可造成呼吸衰竭，甚至死亡[1]。肺間質(zhì)纖維化是上皮細(xì)胞損傷和不良修復(fù)的結(jié)果。目前臨床上對肺纖維化的治療主要是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑/細(xì)胞毒藥物和抗纖維化藥物聯(lián)用或單用，但療效均不佳。經(jīng)臨床實踐與動物實驗研究均證實傳統(tǒng)中藥制劑雄附方可有效治療繼發(fā)性肺纖維化[2]。本研究在前期研究成果的基礎(chǔ)上，通過觀察基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP1與MMP2和內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)中的 TIMP2，在雄附方干預(yù)博萊霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化大鼠模型肺組織中的表達(dá)水平，旨在進(jìn)一步探討雄附方預(yù)防大鼠肺間質(zhì)纖維化的作用機制。

材料和方法

1 主要儀器及試劑 光學(xué)顯微鏡及配套圖像采集與分析軟件(Olympus IX71和imagepro plus6.0)。注射用鹽酸博萊霉素(15 mg/支，粉劑)，日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號870690)，用0.9%氯化鈉注射液稀釋成濃度為0.5%的博萊霉素注射液。兔抗大鼠MMP1、MMP2和TIMP2多克隆抗體(工作濃度1∶150、1∶150、1∶100 和 1∶100)、即用型 SPTM檢測試劑盒和濃縮型DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。自制雄附方(由雄黃粉0.1 g，制白附子粉1.2 g，僵蠶粉1.2 g組成)。醋酸潑尼松片(5 mg/片，片劑)天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn)，批號H12020809。

2 實驗動物及分組 選擇SPF級SD雄性大鼠70只，6周齡，體質(zhì)量(206±16) g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號SCXK-(軍)2002-001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1)℃，相對濕度50%~60%。隨機分為對照組(BC)，假手術(shù)組(PS)，纖維化模型組(MD)，醋酸潑尼松組(PN 5.6 mg/kg)，雄附方高、中、低劑量組(XFFH、XFFM和XFFL 1.4 g/kg、0.7 g/kg、0.35 g/kg)7組，每組10只。

3 肺纖維化大鼠模型制備及給藥 對照組以外的實驗大鼠均給予腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，待大鼠麻醉后將其仰臥位固定在鼠臺上，以75%醫(yī)用酒精常規(guī)消毒皮膚、鋪巾；取頸部正中線剪開皮膚0.5 cm，以血管鉗鈍性分離逐層剝離暴露氣管，用4號針頭從氣管軟骨環(huán)間隙向心端刺入氣管，注入0.3 ml博萊霉素氯化鈉溶液(7.5 mg/kg)或0.9%氯化鈉注射液(假手術(shù)組)，再注入0.3 ml空氣，立即將動物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。再次消毒后縫合肌肉、皮膚。假手術(shù)組除注入氣管等量的0.9%氯化鈉注射液外，其他步驟相同。造模后第2天用0.9%氯化鈉注射液(0.014 L/kg)或相應(yīng)藥物(混懸液0.014 L/kg)每天灌胃(ig)，每周連續(xù)給藥6 d，休息1 d，共給藥4周。給藥4周后斷頭處死，用手術(shù)剪和鑷子摘取雙肺，取部分右中肺組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

4 檢測指標(biāo) 免疫組織化學(xué)染色(SP)法檢測肺組織中MMP1、MMP2和TIMP2的表達(dá)水平。具體步驟參照相關(guān)試劑盒使用說明書。每組染色均設(shè)陽性對照(以已知MMP1、MMP2和TIMP2陽性的乳腺癌組織切片)和陰性對照(以0.01 mol/L PBS代替一抗)組切片染色。MMP1、MMP2和TIMP2的染色陽性定位為胞漿內(nèi)，陽性細(xì)胞均呈棕黃色顆粒顯示，背景清晰無非特異性著色。本研究采用測量累積光密度(integrated optical density，IOD)值定性評價方法，評估各組肺組織中MMP1、MMP2和TIMP2的陽性表達(dá)水平及組間差異。具體操作：選取各組肺組織中每張切片400倍視野中5個有代表性不連續(xù)視野，將所選目的區(qū)域圖像經(jīng)OlympusIX71光學(xué)顯微鏡及其自帶軟件imagepro plus6.0采集并測量其IOD值，每組共需測量和記錄50個IOD值，取均數(shù)后進(jìn)行組間差異比較。本研究選取OD值越大代表目的蛋白陽性表達(dá)水平越高的OD值檢測體系。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)結(jié)果以-x±s表示，采用SPSS16.0 for windows軟件包中單因素方差分析(oneway ANOVA)法進(jìn)行多組間比較及兩兩比較，a=0.05。

結(jié) 果

1 MMP1的表達(dá) MMP1以細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，背景清晰無非特異性著色。陽性細(xì)胞包括肺泡上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞和部分炎細(xì)胞。比較MMP1在各組中的IOD值可以發(fā)現(xiàn)，MMP1在MD組陽性表達(dá)水平最高(455.16±39.08)；PN、XFFM和XFFL組MMP1的陽性表達(dá)強度均高于BC、PS和XFFH組(F=264.715，P＜0.05)；其中XFFH組表達(dá)水平最低(20.11±11.94)。見圖1、表1。

2 MMP2的表達(dá) MMP2的陽性部位在肺泡上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞和部分炎細(xì)胞的細(xì)胞漿。其蛋白表達(dá)水平在MD組陽性表達(dá)為各組之最(253.24±48.72)；PN、XFFM 和 XFFL組 MMP2的陽性表達(dá)強度均高于BC、PS和XFFH組(P＜0.01)，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=168.58，P＜0.05)。其中XFFH組表達(dá)水平最低(33.59±17.32)。見圖1、表1。

3 TIMP2的表達(dá) 在肺泡上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞和部分炎細(xì)胞的細(xì)胞漿中可見TIMP2呈陽性染色。MD組TIMP2蛋白陽性表達(dá)水平最高 (458.96±67.87)；PN、XFFM 和 XFFL 組 MMP1、MMP2和TIMP2的陽性表達(dá)強度均高于BC、PS和XFFH組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=217.48，P＜0.05)。其中BC組表達(dá)水平最低(21.37±15.47)。見圖1、表1。

討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺間質(zhì)纖維化是多種原因引起的成纖維細(xì)胞增殖、MMPs/TIMPs系統(tǒng)平衡被破壞，大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集；發(fā)生過程與受損肺組織發(fā)生實質(zhì)細(xì)胞變性壞死，局部炎細(xì)胞浸潤，氧自由基含量增加，間質(zhì)支撐結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分早期被分解破壞，炎癥后期增生修復(fù)中局部新生成ECM在肺間質(zhì)的沉積過多等因素和環(huán)節(jié)影響有關(guān)[3]。細(xì)胞外基質(zhì)的含量變化與分泌ECM主要成分(如膠原纖維)的肌成纖維細(xì)胞數(shù)量增加相關(guān)，也與受損組織中蛋白水解酶的含量和活性有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)基因激活后可直接降解基底膜和ECM。MMPs與特異性抑制劑TIMPs 特異性結(jié)合之后失活，含量比例平衡直接參與和影響ECM的代謝[4-5]。MMPs與特異性抑制劑TIMPs含量比例平衡，決定著ECM是否過量沉積于肺。

圖1 MMP1、MMP2和TIMP2在雄附方對抗博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化肺組織中的陽性表達(dá)(IHC染色，×400)MMP1： 1a: 正常對照組； 1b: 模型組； 1c: 醋酸潑尼松組； 1d: 雄附方高劑量組； MMP2： 2a: 正常對照組； 2b: 模型組； 2c: 醋酸潑尼松組； 2d: 雄附方高劑量組； TMMP2： 3a: 正常對照組； 3b: 模型組； 3c: 醋酸潑尼松組； 3d: 雄附方高劑量組Fig.1 Expressions of MMP1, MMP2 and TIMP2 in the lung tissue after treatment of bleomycin-induced pulmonary fibrosis with Xiongfufang(IHC staining, ×400)1a: MMP1 in NB; 1b: MMP2 in MD; 1c: MMP2 in PN; 1d: MMP2 in XFFH; 2a: MMP2 in NB； 2b: MMP2 in MD； 2c: MMP2 in PN;2d: MMP2 in XFFH; 3a: MMP2 in NB； 3b: MMP2 in MD； 3c: MMP2 in PN； 3d: MMP2 in XFFH

表1 雄附方對抗博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化4周時各組肺組織中MMP1，MMP2和TIMP2的表達(dá)Tab.1 Expression of MMP1, MMP2 and TIMP2 in different groups 4 weeks after treatment of bleomycininduced pulmonary fibrosis with Xiongfufang

研究結(jié)果顯示：造模4周后，MD組肺組織中MMP1、MMP2和TIMP2活性表達(dá)水平上升，肺組織纖維化程度重；發(fā)生機制可能是肺組織受損后，通過機體代償增多MMP1來降解ECM中的膠原纖維，增多MMP2降解明膠，局部TIMP2蛋白表達(dá)水平代償性升高，但不足以平衡MMP1、MMP2活性比例。雄附方高劑量組肺組織中的MMP1和MMP2表達(dá)水平明顯低于纖維化模型組和其他用藥組，TIMP2表達(dá)水平明顯高于對照組和假手術(shù)組；MMP1和MMP2在損傷后期表達(dá)呈下調(diào)趨勢可能與雄附方上調(diào)局部TIMP2的表達(dá)，造成晚期MMPs/TIMPs比值下降等因素有關(guān)；造成了局部受損組織在損傷后重建過程中ECM沉積減少，組織纖維化程度不明顯。TIMP2高表達(dá)的機制尚不清楚，可能與用藥前博來霉素造成早期局部肺泡上皮損傷，基底膜部分暴露后刺激MMPs表達(dá)水平上升等生物效應(yīng)有關(guān)。醋酸潑尼松組肺組織中的MMP1和MMP2表達(dá)水平明顯低于肺纖維化模型組，但與對照組和假手術(shù)組比較明顯增高，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義；與高劑量雄附方組比較，二者差異也有統(tǒng)計學(xué)意義。雄附方中、低劑量組肺組織中的MMP1、MMP2和TIMP2表達(dá)水平與醋酸潑尼松組相近，說明高劑量是干預(yù)肺間質(zhì)纖維化形成的最佳劑量，為臨床用藥提供了依據(jù)。綜上所述，推測雄附方對抗肺組織纖維化機制可能與其有效平衡肺組織中MMP1、MMP2和TIMP2的表達(dá)水平有關(guān)。

1 King TE Jr， Pardo A， Selman M. Idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Lancet， 2011， 378（9807）：1949-1961.

2 馬玉琛，楊永濱，王勇，等．雄附散阻抗大鼠肺間質(zhì)纖維化的病理形態(tài)觀察［J］.武警醫(yī)學(xué)，2010，21（2）：131-134．

3 Yang K， Palm J， K?nig J， et al. Matrix-Metallo-Proteinases and their tissue inhibitors in radiation-induced lung injury［J］. Int J Radiat Biol， 2007， 83（10）：665-676.

4 Wynn TA. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］. J Pathol， 2008， 214（2）：199-210.

5 Oggionni T， Morbini P， Inghilleri S， et al. Time course of matrix metalloproteases and tissue inhibitors in bleomycin-induced pulmonary fibrosis［J］. Eur J Histochem， 2006， 50（4）：317-325.