趙希文 龐立新 張春林

【摘 要】國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5511—2008規(guī)定，谷物和豆類中粗蛋白質(zhì)含量測定方法為凱氏定氮法。該方法適用范圍廣泛，測定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但因其稱樣量大，消化時間長，蒸餾前需要定容稀釋，操作復(fù)雜費(fèi)時，試劑消耗大，給測定帶來一定麻煩甚至是誤差。就如何縮短消化時間，方便、快捷、準(zhǔn)確地獲得最佳測定結(jié)果，本人在稱樣量、所加試劑的濃度以及吸收液的酸堿度方面進(jìn)行了大膽的嘗試與探析。

【關(guān)鍵詞】谷物和豆類中粗蛋白質(zhì)；測定方法

1.方法原理

蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，樣品與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

2.試劑與儀器

2.1濃硫酸混合液

在100ml水中緩慢加入濃硫酸200ml，冷卻后加入30%過氧化氫300ml，混合均勻。

2.2混合催化劑

硫酸銅10g，硫酸鉀100g，硒粉0.2g，在研缽中研細(xì)過孔徑0.45mm（40目篩），混勻備用。

2.3混合指示劑

2份甲基紅乙醇溶液（稱取0.1g甲基紅置于研缽中加入少許95%乙醇，研磨溶解后，加入75ml95%乙醇）與1份次甲基藍(lán)乙醇溶液（0.1g次甲基藍(lán)溶于80ml95%乙醇中）臨用時混合。

2.4 20g/l硼酸溶液

稱取20g硼酸溶于1000ml水中。

2.5飽和氫氧化鈉溶液

2.6 0.01mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

2.7儀器

凱氏定氮蒸餾裝置。

3.操作步驟

3.1消化

稱取0.050g左右（全部通過40目篩的）固體試樣，移入50ml或100ml定氮瓶中，加入1g混合催化劑，再加入3ml濃硫酸混合液，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，以45度角斜支于有石棉網(wǎng)的電爐上。小火加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止，煙霧變白后，加強(qiáng)火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱10min，取下放冷備用。同時做試劑空白試驗。

3.2蒸餾

連接好定氮蒸餾裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3處，加數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅次甲基藍(lán)指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水至沸騰，反應(yīng)室清洗干凈后，即放緩加熱至反應(yīng)室內(nèi)的殘液不倒吸為宜，向接收瓶內(nèi)加入10ml硼酸溶液及1-2滴混合指示液，并使冷凝管下端插入吸收瓶液面下，將定氮瓶中消化液用蒸餾水少量多次沖冼，使之全部干凈地轉(zhuǎn)移至反應(yīng)室中，清洗進(jìn)樣口管路，塞緊棒狀玻塞，加水封嚴(yán)。加熱，待反應(yīng)室內(nèi)有熱氣進(jìn)入，立即打開堿液管活塞加入飽和氫氧化鈉至溶液呈現(xiàn)深褐色，停止加入，擰緊活塞，開始蒸餾。待吸收瓶中溶液出現(xiàn)綠色記時5min，到時后將接收瓶放低，繼續(xù)蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管下部。

3.3滴定

取下接收瓶，以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定至淡紫色（灰紅色）為終點，同時做試劑空白試驗。

3.4計算

試樣中蛋白質(zhì)含量按下式計算：

X=（V1-V0）×C×0.0140×F×100/m×（1-M）

式中： X——試樣中蛋白質(zhì)含量，單位為g/100g或g/100ml；

V1、V0——試樣、空白液消耗標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為ml；

C——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度，單位為mol/L；

0.0140——1.0ml硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，

單位為克；

m——試樣質(zhì)量或體積，單位為克或毫升；

F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；

M——試樣水分%

4.試驗方法探析

（1）稱取的試樣量由標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的0.2-0.3g改為0.050g左右，可將消化時間由原來的2-3h縮短為40min，由于樣品量減少還可免去消化液稀釋定容帶來的麻煩與誤差。

不同稱樣量測試結(jié)果比對

不同稱樣量空白加標(biāo)回收率測試比對

上述測試結(jié)果表明，對粗蛋白質(zhì)含量較高的樣品減小稱樣量，無論對結(jié)果的準(zhǔn)確性還是重現(xiàn)性都無任何影響。這樣既節(jié)省時間，提高工作效率，又降低了實驗成本，降低了對環(huán)境的污染。

（2）氫氧化鈉由400g/l改為飽和溶液。因為在蒸餾過程中，消化液中的硫酸銨若沒有足夠的堿來中和，很難使氨徹底分離出來，甚至導(dǎo)致整個測定失敗。氫氧化鈉在本方法中的作用有兩個方面，一是中和樣品消化液中剩余的酸，二是為氨的有效分離提供一個堿性環(huán)境。所以我們在盡量不增加反應(yīng)室內(nèi)液體體積的前提下，采取加入飽和氫氧化鈉來保證氨的有效分離，徹底放出，得到可靠、準(zhǔn)確的測定結(jié)果。（下轉(zhuǎn)第184頁）

（上接第75頁）（3）將20g/l的硼酸吸收液PH值調(diào)整為5.4左右。因甲基紅和次甲基藍(lán)混合指示劑的PH變色范圍為5.4，只有當(dāng)酸堿反應(yīng)的等當(dāng)點，落在指示劑PH值變色點范圍內(nèi)，所得的測定結(jié)果才愈準(zhǔn)確，多次實踐證明也只有當(dāng)硼酸的PH值在5.4左右時，空白值才能出現(xiàn)正常，既消耗標(biāo)液體積在0.2-0.4ml，同時空白加標(biāo)回收率才能達(dá)到理想的效果，否則，將出現(xiàn)空白值為零，空白加標(biāo)回收率偏高或偏低現(xiàn)象，測定結(jié)果準(zhǔn)確性差。

5.注解與注意事項

（1）稱量好的樣品要用長條狀蠟光紙一次送入凱氏燒瓶底部，切勿沾附瓶頸部，如有少量沾附可用少量蒸餾水沖入底部。

（2）消化時，要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，采用長頸園底凱氏燒瓶以45度角斜支于電爐上，瓶口置一小漏斗，增加酸液回流，加速消化。

（3）消化過程中，樣品中有機(jī)質(zhì)如淀粉分解轉(zhuǎn)化為糖類，高溫下變黑，并產(chǎn)生泡沫，這時要先小火，勿使黑色物質(zhì)上升到凱氏燒瓶頸部，待消化液泡沫消失，均勻沸騰后，再加大火力，直至消化液黃色完全消失呈淡藍(lán)色透明為止。

（4）消化時應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，使之徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過氧化氫后，再繼續(xù)加熱消化至完全。

（5）如樣品含脂肪較多時，可適當(dāng)增加硫酸量，因硫酸量少時，過多的硫酸鉀會與硫酸生成硫酸氫鉀而不與氨作用，導(dǎo)致氨損失，使結(jié)果偏低。

（6）蒸餾時，蒸汽發(fā)生要均勻、充足，蒸餾中途不得?；饠鄽?，否則發(fā)生倒吸，加堿時動作要快，防止氨損失，并注意不能使堿液污染冷凝管及接收瓶，如發(fā)現(xiàn)堿污染，應(yīng)立即停止蒸餾，待清洗干凈后再蒸餾。

（7）蒸餾前冷凝管出口就要浸入吸收液中，防止氨揮發(fā)損失。蒸餾結(jié)束后，應(yīng)先將吸收液離開冷凝管口，以免發(fā)生倒吸，再蒸餾1min。

（8）蒸餾過程中硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃，否則氨吸收減弱，造成檢測結(jié)果偏低。必要時可把接收瓶置于冷水浴中。

（9）蒸餾是否完全，可用精密PH試紙測試?yán)淠芸诘睦淠杭右源_定。

（10）當(dāng)采用甲基紅與次甲基藍(lán)混合指示劑時，滴定終點應(yīng)為淡紫色（灰紅色）而且要控制樣品與空白終點顏色的一致性。

（11）消化液若不能很快蒸餾，應(yīng)保存消化液，蒸餾前再加水。

【參考文獻(xiàn)】

[1]國家標(biāo)準(zhǔn)《食品衛(wèi)生檢驗方法 理化部分（二）》.

[2]遼寧省糧食局編著.糧油質(zhì)量檢驗手冊.