王立衛(wèi)，閆正，邢超，郭莎，葉玲菊

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002)

李彥平

(保定市疾病預(yù)防控制中心，河北保定 071000)

葡萄酒生產(chǎn)工藝決定葡萄酒的生產(chǎn)需要一個(gè)較長(zhǎng)的釀制過(guò)程。一些生產(chǎn)廠商為了快速謀取暴利，利用著色劑及其它原料勾兌生產(chǎn)假冒葡萄酒，嚴(yán)重危害人體健康。GB 15037–2006［1］規(guī)定，葡萄酒中不得添加合成著色劑、甜味素、香精、增稠劑。人工合成著色劑莧菜紅及亮藍(lán)是兩種較常使用在葡萄酒中的人工合成色素。因此葡萄酒中莧菜紅及亮藍(lán)的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

GB/T 5009.35–2003［2］規(guī)定食品、飲料、配制酒中合成著色劑的測(cè)定方法有高效液相色譜法［3］、薄層色譜法［4］、示波極譜法［5］，這些方法均需樣品預(yù)處理，操作繁瑣，不利于快速分析。GB/T 15038–2006［6］中未介紹葡萄酒中合成色素的檢測(cè)方法，葡萄酒中添加劑的檢測(cè)多借鑒飲料或配制酒的檢驗(yàn)方法。高效液相色譜法經(jīng)聚酰胺粉吸附法處理樣品后，進(jìn)行定量分析時(shí)準(zhǔn)確度變差；薄層色譜法分辨率、靈敏度及準(zhǔn)確度均較低；示波極譜法對(duì)環(huán)境有污染且受干擾因素影響較多，定性較為困難。另外食品中人工色素的分析方法還有分光光度法［7］、高效液相色譜 – 質(zhì)譜法［8］、高效毛細(xì)管電泳法［9］等。筆者建立了高效毛細(xì)管電泳法直接測(cè)定葡萄酒中莧菜紅及亮藍(lán)的方法，該方法不需樣品預(yù)處理，操作簡(jiǎn)便，分析速度快，可為葡萄酒中人工色素的測(cè)定提供新的參考方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效毛細(xì)管電泳儀：TH–3000型，保定天惠分離科學(xué)研究所；

未涂層毛細(xì)管：河北永年光導(dǎo)纖維廠；

自動(dòng)雙重純水蒸餾器：SZ–93型，上海亞榮生化儀器廠；

酸度計(jì)：pHS–3C型，上海偉業(yè)儀器廠；

檸檬酸、β–環(huán)糊精、氫氧化鈉、鹽酸：分析純；

莧菜紅、亮藍(lán)：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中心；

葡萄酒樣品：保定市疾病預(yù)防控制中心；

實(shí)驗(yàn)室用水均為二次蒸餾水。

1.2 溶液配制

樣品緩沖溶液：10 mmol/L檸檬酸。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取 0.10，0.25，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 mL 的0.5 mg/mL莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液及0.5 mg/mL亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL容量瓶中，用樣品緩沖溶液定容至標(biāo)線，搖勻，配制成2，5，10，20，40，100，200 mg/L 的莧菜紅及亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 電泳分離條件

分離緩沖溶液：10 mmmol/L檸檬酸溶液–5 mmmol/L β– 環(huán)糊精溶液 (pH 2.6)；未涂層彈性石英毛細(xì)管柱：50 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度為39 cm；壓力進(jìn)樣：20 kPa，3 s；電泳電壓：20 kV；電泳溫度：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

新毛細(xì)管在使用前以1 mol/L鹽酸溶液及1 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗20 min，然后用二次蒸餾水和分離緩沖液分別沖洗5 min。每次分析樣品后用分離緩沖溶液沖洗毛細(xì)管柱2 min以保證重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

亮藍(lán)在紫外區(qū)最大吸收波長(zhǎng)為220 nm，莧菜紅在220 nm處亦有較大紫外吸收［10］，緩沖溶液背景在220 nm處干擾較小。為實(shí)現(xiàn)兩者的同時(shí)測(cè)定且在獲得盡可能高的靈敏度同時(shí)避免基體干擾，本實(shí)驗(yàn)選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 分離緩沖體系選擇

莧菜紅及亮藍(lán)分子結(jié)構(gòu)中均含有磺酸基，在一定條件下電離成帶一個(gè)或多個(gè)負(fù)電荷的粒子，產(chǎn)生電泳行為。在堿性條件下，莧菜紅及亮藍(lán)分子電離后帶負(fù)電荷，正極進(jìn)樣后其電遷移方向?yàn)樨?fù)極到正極，與電滲流方向相反，當(dāng)電滲流足夠大時(shí)才能從負(fù)極流出毛細(xì)管柱，產(chǎn)生色譜峰。在酸性條件下，負(fù)極進(jìn)樣后，其電遷移方向?yàn)樨?fù)極到正極，當(dāng)離子電泳淌度大于電滲淌度時(shí)可從正極流出毛細(xì)管柱，產(chǎn)生色譜峰。分別選取磷酸鹽體系、NaAc–HAc體系、硼砂體系及檸檬酸緩沖體系進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，磷酸鹽體系及硼砂體系中莧菜紅不出峰，且分析樣品時(shí)雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重；而在NaAc–HAc體系中亮藍(lán)及莧菜紅出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；檸檬酸緩沖體系中莧菜紅及亮藍(lán)保留時(shí)間合適且峰形較尖銳，測(cè)定樣品時(shí)莧菜紅及亮藍(lán)先于雜質(zhì)峰流出，避免了雜質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)最終選擇檸檬酸緩沖體系，和絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)所選用的堿性硼砂體系與磷酸鹽體系不同［11，12］。

2.3 分離緩沖溶液pH值對(duì)遷移時(shí)間的影響

毛細(xì)管的電滲流(EOF)對(duì)于pH值的改變很敏感，且pH值變化亦可引起分離度以及峰形等參數(shù)的改變。較低pH值的檸檬酸緩沖溶液中可以抑制緩沖溶液的電滲流，改變pH值可以改變莧菜紅及亮藍(lán)的電泳分離度，提高莧菜紅及亮藍(lán)的分離效率?？疾炝藱幟仕崛芤涸趐H 2.2～3.0范圍內(nèi)對(duì)遷移時(shí)間的影響(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，兩者在pH 2.2～3.0范圍內(nèi)均能達(dá)到完全分離，在pH 2.4時(shí)兩者的保留時(shí)間最短，但在測(cè)定樣品時(shí)當(dāng)pH 2.4時(shí)亮藍(lán)不出峰，最終選擇緩沖溶液為pH 2.6。

圖1 pH值對(duì)莧菜紅及亮藍(lán)的保留時(shí)間的影響

2.4 分離緩沖液濃度對(duì)分離效果的影響

在恒定條件下，增大緩沖液的濃度可以抑制吸附而增加靈敏度，降低電滲流而增加分離效率，但濃度太高會(huì)產(chǎn)生較多熱量。在保持pH值及分離電壓不變的條件下，考察5種不同濃度檸檬酸溶液對(duì)莧菜紅及亮藍(lán)分離情況的影響(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明，隨著檸檬酸溶液濃度的增大，分離時(shí)間變短，在10 mmol/L時(shí)莧菜紅及亮藍(lán)峰分離度最大，且保留時(shí)間較短，最終選擇檸檬酸溶液濃度為10 mmol/L。

2.5 添加劑對(duì)峰形及分離度的影響

考察了十二烷基磺酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)及β-環(huán)糊精對(duì)樣品中莧菜紅及亮藍(lán)分離情況及峰形的影響，發(fā)現(xiàn)SDS及CTAB對(duì)樣品中莧菜紅及亮藍(lán)的分離情況及峰形無(wú)明顯改善，而β-環(huán)糊精在分析樣品中的莧菜紅及亮藍(lán)時(shí)，可明顯改善峰形，使峰形變銳。考察了不同濃度β-環(huán)糊精對(duì)峰形的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)β-環(huán)糊精濃度大于5 mmol/L后，莧菜紅及亮藍(lán)的峰形變化不明顯，且環(huán)糊精容易析出，最終確定β-環(huán)糊精的濃度為5 mmol/L。

圖2 檸檬酸濃度對(duì)莧菜紅及亮藍(lán)保留時(shí)間的影響

2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢出限

在1.3實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)莧菜紅及亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析，以電泳譜圖的峰面積y(μV·s)與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度x(mg/L)進(jìn)行線性回歸分析，得到莧菜紅及亮藍(lán)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)及檢出限(LOD，信噪比為3)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 莧菜紅及亮藍(lán)的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.7 方法精密度及回收率

取1 mL樣品于5 mL刻度試管中，用樣品緩沖溶液定容至5 mL，混合均勻后直接進(jìn)樣，按1.3實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定7次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表2，莧菜紅及亮藍(lán)色譜峰見(jiàn)圖3。由表2可知，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定莧菜紅的方法精密度為1.5%，亮藍(lán)的方法精密度為2.9%，表明本方法精密度良好。

表2 樣品中的莧菜紅及亮藍(lán)

取3份已測(cè)樣品，分別加入低、中、高3個(gè)濃度水平的莧菜紅及亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平樣品平行處理6份，莧菜紅及亮藍(lán)的加標(biāo)回收率見(jiàn)表3。

圖3 優(yōu)化條件下樣品中莧菜紅及亮藍(lán)的電泳圖

表3 樣品加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 結(jié)語(yǔ)

用高效毛細(xì)管電泳法直接測(cè)定葡萄酒中莧菜紅及亮藍(lán)人工合成色素，該方法具有較高的靈敏度和分辨率，且分離快速、操作簡(jiǎn)單、節(jié)省溶劑、用樣量少，能滿足實(shí)際樣品的分析需求。

［1］GB 15037–2006 葡萄酒［S］.

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