晉文慧，方華，謝全靈，陳偉珠，洪專，易瑞灶

(國家海洋局第三海洋研究所，國家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術研究中心，福建廈門 361005)

海洋脂類活性物質(zhì)是一類具有獨特生理功能的化合物，富含ω-3系高度不飽和脂肪酸(PUFA)，主要包括二十碳五烯酸 (cis-5，8，11，14，17-eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(cis-4，7，10，13，16，19-Docosahexaenoic Acid，DHA)等［1-3］。EPA和DHA都是人體所必需的脂肪酸，但在人體內(nèi)難以合成，主要來自于海洋魚類，是理想的功效食品或營養(yǎng)品，具有調(diào)節(jié)血脂、軟化血管、降低血液粘度、改善視力、促進生長發(fā)育和提高人體免疫功能等作用［4］，其中EPA被譽為“血管清潔劑”，具有降血脂、抗血小板聚集、延緩血栓形成的作用；DHA被稱為“腦黃金”，具有健腦作用。EPA，DHA與人體許多生命現(xiàn)象有關，對維護人體健康有重要作用，在醫(yī)藥和食品等許多領域有著廣泛的應用，并已廣泛應用于各種保健食品中［5-6］。目前，有關海洋不飽和脂肪酸酯的制備、檢測、表征及藥理作用已有很多文獻報道［7-11］。筆者采用甘油酯型魚油為起始原料，通過皂化和?；磻苽涠嗖伙柡椭舅峒柞ィ?jīng)過層析、精制得到高純度的EPA甲酯和DHA甲酯標準樣品，并利用紅外光譜、質(zhì)譜、1H和13C 核磁共振波譜等手段對海洋不飽和脂肪酸甲酯的結構進行了表征。

近年來國內(nèi)外對脂肪酸的研究日益廣泛深入，脂肪酸甲酯標準品是定性定量檢測其相應的不飽和脂肪酸的重要標準物質(zhì)，而高不飽和脂肪酸的檢測研究、提取分離研究和醫(yī)藥研究均需要相應的高純度不飽和脂肪酸甲酯標準物質(zhì)作為其研究的前提保證。本工作為標準樣品的研制提供了必要的基礎。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀：3100型，美國Waters公司；

氣相色譜儀：GC2010-Plus型，配FID檢測器，日本島津公司；

紅外光譜儀：VERTEX 70型，德國Bruker公司；

核磁共振波譜儀：400 MHz型，德國Bruker公司；

超純水純化系統(tǒng)：Milli-Q型，美國Millipore公司；

甘油酯型魚油粗品：國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司；

氫氧化鉀、叔丁基-4-羥基茴香醚、草酰氯、二甲基甲酰胺、三乙胺、二氯甲烷：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

硝酸銀-硅膠層析柱：自制；

正已烷：色譜純。

1.2 EPA甲酯和DHA甲酯的制備

采用甘油酯型魚油為起始原料，通過皂化和?；磻苽涠嗖伙柡椭舅峒柞?。游離多不飽和脂肪酸甲酯粗產(chǎn)物根據(jù)文獻的方法制備［12］。步驟如下：

(1)皂化反應。將適量氫氧化鉀、乙醇、水和叔丁基-4-羥基茴香醚加入到反應瓶中，充分溶解，待混均后，再加入粗魚油，均勻攪拌。在充氮氣條件下，于75℃恒溫持續(xù)攪拌1 h。待溶液冷卻后，用硫酸溶液中和皂化液，調(diào)節(jié)使其pH值為2～3，然后將皂化液移入分液漏斗中，上層即為游離脂肪酸液。

(2)甲酯化反應。在冰水浴條件下，將不飽和脂肪酸、甲醇按物質(zhì)的量比1∶1.2于反應瓶中混合，慢慢加入適量草酰氯充分混合，0.5 h后再滴加適量二甲基甲酰胺。反應1.5 h后將上述溶液滴加到適量甲醇、三乙胺和二氯甲烷的混合液中，冰水浴下反應1 h。用二氯甲烷萃取2次，合并有機相，用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋蒸，純化，得到不飽和脂肪酸甲酯粗品。

1.3 EPA甲酯和DHA甲酯的分離純化

1.3.1 層析柱分離提純

稱取2 g不飽和脂肪酸甲酯粗品，加入硝酸銀-硅膠層析柱中，以丙酮-石油醚混合溶液進行洗脫，起始洗脫劑為石油醚，在洗脫過程中逐漸增加丙酮的比例直至20%，控制洗脫流速為1 mL/min，每50 mL收集洗脫液進行氣相色譜測定，合并含量相同的洗脫液，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至溶劑揮干，可分別獲得較高純度的EPA甲酯和DHA甲酯(純度高于70%)，于-18℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 液相色譜技術精制

分別以經(jīng)過層析柱分離提純的EPA甲酯和DHA甲酯作為原料，使用C18色譜柱(250 mm×20 mm)進行分離精制，收集純度高于99%的餾分片段，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至溶劑揮干，再經(jīng)高真空石油醚三級油擴散泵蒸干，即可得到純度較高的DHA甲酯和EPA甲酯。

1.4 色譜條件

色譜柱：聚乙二醇類FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；柱流量：1.0 mL/min；進樣體積：1 μL；選擇分流進樣，分流比為1∶10；進樣口溫度：260℃；柱溫：以100℃為初始溫度，保持5 min，以5℃/min的速率升高至220℃，保持20 min；檢測器溫度：270℃。

1.5 分析檢測

取精制的EPA甲酯和DHA甲酯單體各10 mg，置于10 mL的容量瓶中，加入正己烷稀釋至標線，按1.4色譜條件進行氣相色譜分析，按照面積歸一法計算純度，經(jīng)氣相色譜檢測其純度均高于99%。EPA甲酯和DHA甲酯單體的GC色譜圖見圖1、圖2。

圖1 EPA甲酯單體的GC分析譜圖

圖2 DHA甲酯單體的GC分析譜圖

1.6 實驗條件

1.6.1 紅外吸收光譜

KBr壓片液膜法；波數(shù)范圍：7 500～370 cm-1；分辨率：0.4 cm-1；采樣速率：80張/秒。

1.6.2 質(zhì)譜

API電離源，源溫度為120℃；毛細管電壓：3.5 kV；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氮氣流速：500 L/h；錐孔氮氣流速：50 L/h。

1.6.3 核磁共振波譜

1H譜工作頻率：400 MHz；采樣時間：2 s；脈沖寬度：2.1 μs；延遲時間：10 s。

13C譜工作頻率：100 MHz；采樣時間：0.5 s；脈沖寬度：8.7 μs；延遲時間：1 s。

實驗溫度：20℃；溶劑：CDCl3；內(nèi)標：δTMS0。

2 結果與討論

2.1 EPA甲酯的結構表征

二十碳五烯酸甲酯的結構式如圖3所示。

圖3 EPA甲酯的結構式

2.1.1 紅外吸收光譜(IR)

圖4為EPA甲酯的紅外光譜圖。由圖4可知，3 012 cm-1為烯烴的C=C雙鍵伸縮振動，2 961 cm-1為烷烴的C—H伸縮振動，1 741 cm-1為甲酯的C=O伸縮振動，1 155 cm-1為甲酯的C—O伸縮振動，709 cm-1為順式烯烴上C—H的變形振動，是一個特征峰。樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)說明結構中存在碳碳雙鍵C=C、酯鍵及順式碳碳雙鍵等基團。

圖4 EPA甲酯的紅外光譜圖

2.1.2 質(zhì)譜

該化合物化學式為C21H32O2，其相對分子質(zhì)量理論值為316，測得準分子離子峰m/z=317 ［M+H］+與其理論值相符。

2.1.3 核磁共振譜

圖5 EPA甲酯的13C NMR核磁共振譜圖

圖6 EPA甲酯的1H NMR核磁共振譜圖

圖7 EPA甲酯的的HMBC譜圖

化合物EPA甲酯的化學式為C21H32O2，不飽和度Ω=6。圖5～圖7分別為EPA甲酯的碳譜圖、氫譜圖、HMBC譜圖。根據(jù)13C NMR譜圖，6個不飽和度分別由10個烯碳CH(5個不飽和度)和1個羰基碳C(1個不飽和度)組成。由圖5和圖6可知，化合物EPA甲酯含有1個CH3，1個OCH3，8個CH2，5個—CH=CH—和一個羰基C=O。根據(jù)1H NMR和HMBC譜圖數(shù)據(jù)，可以確認單重峰δ3.68(s，3H，OCH3)是一個連著羰基的甲氧基—OCH3(HMBC：H22和C1有耦合)，而三重峰δ0.99(t，3H，J=7 Hz，CH3)和多重峰δ2.09～2.15 (m，2H，CH2)相連組成—CH2—CH3片段接在烯碳端(HMBC ：H20和 C19，C18有耦合，H19和 C18，C20有耦合)。多重峰δ1.69～1.76 (m，2H，CH2)同時與羰基碳174.0、雙鍵碳127.0及亞甲基碳26.55和33.43都有耦合，可以確定δ2.33 (t，J=7 Hz，2H，CH2)、δ2.09～2.15 (m，2H，CH2)和δ1.69～1.76 (m，2H，CH2)是一組—CH=CH—CH2—CH2—CH2—C=O的分子片段 (HMBC ：H2和 C1，C3；H3和 C1，C2，C4，C5有耦合；H4和 C3，C5有耦合 )。另一方面，位于δ5.32～5.43 (m，10H，5 —CH=CH—)的多重峰指認為5個—CH=CH—的分子結構片段，經(jīng)詳細辨認其耦合裂分常數(shù)J=7.2 Hz，也證實了此雙鍵是順式結構。

分子中除去C=O， —O—CH2—CH3，—CH2—CH3， —CH=CH—CH2—CH2—CH2—C=O和5個—CH=CH—，還有4個亞甲基，1H NMR顯示一組多重峰 2.81～2.87 (m，8H，4CH2)，由化學位移和HMBC可以指認這4個CH2分別位于5個烯鍵中間。

綜上所述，樣品的核磁共振譜圖(1H NMR，13C NMR，13C-1H HMBC)所給出的結構信息與化合物EPA甲酯的化學結構式相符。

2.2 DHA甲酯的結構表征

DHA甲酯的結構式如下：

圖8 DHA甲酯的結構式

2.2.1 紅外吸收光譜(IR)

如圖9所示，3 013為烯烴的C=C雙鍵伸縮振動，2 963 cm-1為烷烴的C—H伸縮振動，1 742 cm-1為甲酯的C=O伸縮振動，1 161 cm-1為甲酯的C—O伸縮振動，709 cm-1為順式烯烴上C—H的變形振動，是一個特征峰。樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)說明結構中存在碳碳雙鍵C=C、酯鍵及順式碳碳雙鍵等基團。

圖9 DHA甲酯的紅外光譜圖

2.2.2 質(zhì)譜

該化合物化學式為C23H34O2，其相對分子質(zhì)量理論值為342，測得準分子離子峰m/z=343 ［M+H］+，與其理論值相符。

2.2.3 核磁共振譜

圖10 DHA甲酯的13C NMR核磁共振譜圖

圖11 DHA甲酯的1H NMR核磁共振譜圖

圖12 DHA甲酯的的HMBC譜圖

化合物DHA甲酯的分子式為C23H34O2，不飽和度Ω=7。圖10～圖12分別為DHA甲酯的13C NMR，1H NMR，HMBC譜圖。根據(jù)13C NMR譜，7個不飽和度分別是由12個烯碳CH(6個不飽和度)和1個羰基碳C(1個不飽和度)組成。根據(jù)圖10和圖11，化合物DHA甲酯含有1個CH3，1個OCH3，8個 CH2，6個 —CH=CH—和一個羰基C=O。根據(jù)1H NMR，HMBC譜圖，可以確認單重峰δ 3.68 (s，3H，OCH3)是一個連著羰基的甲氧基—OCH3(HMBC：H24和 C1有耦合 )，而三重峰 δ 0.99 (t，3H，J=7 Hz，CH3)和多重 峰 δ 2.05～2.12(m，2H，CH2)相連組成—CH2—CH3片段接在烯碳端 (HMBC ：H22和 C21、C20有耦合，H21和 C20、C22有耦合 )。同時，位于 δ 5.29～5.46 (m，12H，6—CH=CH—)的多重峰指認為6個—CH=CH—的分子結構片段，經(jīng)詳細辨認其耦合裂分常數(shù)J=7.2 Hz，也證實了此雙鍵是順式結構。

分子中除去O=C，—OCH3，—CH2—CH3和6個—CH=CH—的分子結構片段，還有7個亞甲基，1H NMR顯示2組多重峰δ 2.81～2.87 (m，10H，5CH2)、2.37～2.44 (m，4H，2CH2)，由化學位移和HMBC可以確認有5個CH2分別位于5個烯鍵中間，而 δ 2.37～2.44 指認為—CH2—CH2—分子片段，且此分子片段與羰基C1有耦合作用，所以它們組成—CH2—CH2—C=O片段。

綜上所述，樣品的核磁共振譜圖(1H NMR，13C NMR，13C-1H HMBC)所給出的結構信息與化合物DHA甲酯的化學結構式相符。

3 結語

制備了兩種高純不飽和脂肪酸甲酯，為標準樣品的研制工作打下了堅實的基礎，也為高不飽和多烯脂肪酸進一步的檢測研究和醫(yī)藥研究提供了基礎保障。

［1］黃明發(fā)，吳桂蘋，焦必寧.二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的生理功能［J］.食品與藥品，2009，9(2): 69-71.

［2］陶寧萍，鮑丹.魚油的營養(yǎng)和藥用價值及其提取工藝的研究進展［J］.上海水產(chǎn)大學學報，2005，14(2): 197-200.

［3］馬永鈞，楊博.海洋魚油深加工技術研究進展［J］.中國油脂，2011，36(4): 1-5.

［4］胡燕，陳忠杰.不飽和脂肪酸與人體健康關系探討［J］.肉類研究，2011(1): 17-20.

［5］趙亞平，吳守一，陳鈞，等.魚油中二十碳五烯酸和二十二碳六稀酸提取分離研究現(xiàn)狀和進展［J］.江蘇理工大學學報，1996，17(4): 1-6.

［6］唐君，張春枝，吳文忠.一種魚油中EPA和DHA富集的新方法［J］.大連工業(yè)大學學報，2008，27(2): 102-104.

［7］彭宏偉，張博，楊小川，等. HPLC法測定魚魚油中二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸的含量［J］.中國藥房，2010，21(13):1 228-1 230.

［8］冀克儉，劉元俊，張銀生，等.魚油多烯脂肪酸乙酯的NMR表征［J］.化學分析計量，2001，10(3): 3-5.

［9］Alkio M，Gonzalez C，J?ntti M，et al. Purification of polyunsaturated fatty acid esters from tuna oil with supercritical fl uid chromatography［ J］. Journal of the American Oil Chemistry Society，2000，77(3): 315-321.

［10］Liu D Y，Jiang J，Wang P， et al. Simultaneous quantitative determination of olmesartan and hydrochlorothiazide in human plasma and urine by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography B，2010，879: 743-748.

［11］Spoof L，Neffl ing M R，Meriluoto J. Separation of microcystins and nodularins by ultra performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography B，2009，877: 3 822-3 830.

［12］余元祥，牟峻，榮會，等.五種高不飽和多烯脂肪酸甲酯實物標準樣品研制［J］.檢驗檢疫科學，1999，9(3): 33-37.