張怡 譚樹華

(1.中國藥科大學生命科學與技術學院分子生物學教研室 江蘇南京 210009;2.中國藥科大學生命科學與技術學院 江蘇南京 210009)

在利用基因工程進行蛋白的生產時,通常使用構建融合蛋白的方法,最常使用的融合蛋白標簽包括大腸桿菌的麥芽糖結合蛋白MBP,谷胱甘肽轉移酶GST,組氨酸殘基組成的融合標簽TrxHIS等。借助于融合蛋白的特征和性質,能夠大大簡便蛋白的表達純化、鑒定及檢測過程。目前,通過構建融合蛋白進行表達在原核表達體系以及真核表達體系均有較廣的應用。

當重組蛋白作為基因工程藥品及其他一些用途時,由于融合標簽是否會影響蛋白的性質和功能還有待考察研究,所以一般要求目標產物必須像天然蛋白質一樣的完整產物,而不能以融合蛋白形式存在。因此,一般需要對融合表達產物進行產物后加工,即對融合蛋白在體外實施特定氨基酸序列的切割和斷裂,獲得完整的目的產物。目前最為常用的裂解方法有:(1)化學法:如用溴化氰斷裂;(2)蛋白酶法:如用凝血酶,活化的Xa因子或腸激酶特異性裂解。由于溴化氰為劇毒化合物,而且其切割識別位點為Met,因此實用性不強。用蛋白酶進行切割時,要求工具酶:①能夠識別并裂解特定的氨基酸序列;②為避免雜質蛋白酶引發(fā)不必要的裂解反應,需要高純度的工具蛋白酶。但是目前常用的工具蛋白酶成本較高,價格昂貴,不利于放大生產。這樣,就給IMPACT-TWIN蛋白純化系統(tǒng)的應用提供了廣闊的空間。

IMPACT-TWIN系統(tǒng)包括pTWIN1,pTWIN2兩個表達載體,他們都使用了經改造過的Ssp DnaB內含肽作為intein1。兩者的區(qū)別在于使用了不同的intein2,pTWIN1使用了改造后的Mxe GyrA內含肽作為intein2;而pTWIN2使用的是Mth RIR1內含肽。Intein是一個蛋白剪接元件,類似于基因組中的內含子intron在RNA剪接中的作用,intein在較低的溫度和還原條件下會發(fā)生自身介導的末端裂解反應。此外IMPACT-TWIN系統(tǒng)另外一個重要元件幾丁質結合蛋白域(CBD),CBD源于Bacillus circulans WL-2的幾丁質酶A1的C端片段。由于CBD可高度特異地結合于幾丁質上,可用來作為融合蛋白純化過程中的親和標簽(Watanab et al.,1994;Chong et al.,1997;Xu et al.2000)。

IMPACT-TWIN系統(tǒng)的表達載體中,在多克隆位點兩端都設計了一段intein和CBD的融合基因,如下:幾丁質結合蛋白域(CBD)-intein1-MCS-intein2-幾丁質結合蛋白域(CBD)。所以有3種融合方法,即目的蛋白的N-端,C-端或者N-端和C-端可同時融合上幾丁質結合蛋白域(CBD)-intein。目的蛋白的N端連接Ssp DnaB自剪切元件時,可以通過改變pH和溫度,而不需要使用任何化學試劑。Intein加到目的蛋白C端時,他們的的純化是利用硫醇誘導Mxe GyrA或者Mth RIR1intein的剪切。

pTWIN質粒利用T7啟動子控制融合基因的表達。在沒有IPTG誘導表達時,阻遏物結合到lac操縱子序列上,融合基因的表達被抑制。pTWIN載體有氨芐抗性,可以使宿主菌擁有氨芐抗性。

蛋白表達純化系統(tǒng)IMPACT-TWIN中,幾丁質蛋白結構域(CBD)、蛋白自剪接元件(intein)、目的蛋白連接形成融合基因,在宿主細胞中表達,融合蛋白可利用CBD與幾丁質親和層析柱進行結合,此時,再利用在特定的條件下誘導內含肽的肽鍵裂解活性,目的蛋白與CBD及內含肽分開,從親和層析柱釋放出來,而內含肽與CBD仍結合在幾丁質純化介質上,達到了單柱分離純化的目的。經過分析,此法得到的蛋白與天然蛋白一致,不會殘留或缺失氨基酸,也避免了后續(xù)實驗中蛋白酶與目的蛋白分離純化的麻煩,是一種高效率,低成本,安全性高的蛋白質分離純化系統(tǒng)。

IMPACT-TWIN分離純化系統(tǒng)已在多領域得到應用。將CBD連接到intein的N端,突變的CBD序列連接到intein C端。40mM MESNA誘導過夜,intein N端發(fā)生剪切,CBD的C端則出現(xiàn)了一個硫酯鍵,N端含有半胱氨酸的抗體就可連接到CBD的C端,借助于幾丁質柱材便可實現(xiàn)純化過程(Sun L,Ghosh I,Xu M Q.Journal of immunological methods,2003,282(1):45-52.)。維他命D受體基因克隆到表達載體pTWIN1中,通過改變pH的方法,使目的蛋白N端的intein發(fā)生自剪切反應,釋放出來維他命D受體蛋白(Collins E D,Espinoza A,Le L T N,et al.The Journal of steroid biochemistry and molecular biology,2010,121(1):121-123.)。IMPACT-TWIN蛋白表達純化系統(tǒng)克服了有抗菌活性的β防御素表達困難的缺陷,提供了一個方便經濟的表達方式,實現(xiàn)了其在臨床上應用的可能(Zhao Y,Diao H,Ni Z,et al.Cellular and Molecular Life Sciences,2011,68(4):697-708.)。增強型綠色熒光蛋白(EGFP),自剪接元件intein,可以定位于細胞膜的冰核蛋白(INP)構成的融合蛋白,在室溫pH10.0 Tris–HCl中,由于intein的自剪切,EGFP被釋放出來,經離心即可獲得目的蛋白。此過程不必涉及破菌過程,可用于重組蛋白的工業(yè)化生產(Wu J Y,Tsai T Y,Liu T T,et al.,2011,54(3):158-163.)。