張繼云 王 梅

（新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 新疆 烏魯木齊 830000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種免疫功能紊亂、產(chǎn)生一系列自身抗體，可累及多種臟器的自身免疫性疾病。其臨床表現(xiàn)多樣，病情往往呈緩解和惡化交替進行，發(fā)病機制尚不明確。SLE免疫調(diào)節(jié)異常的表現(xiàn)極其復(fù)雜，包括自身反應(yīng)性淋巴細胞耐受異常、凋亡異常、細胞因子分泌及其受體表達異常以及對激活信號內(nèi)源性反應(yīng)增高等［1－2］。我們推測SLE患者體內(nèi)高水平的TNF－α可能通過激活I(lǐng)KK－β，使IKKβ／NF－κB通路異?；罨?，參與了SLE的發(fā)病。

1 材料與方法

1.1 研究對象：20例SLE女性住院患者，年齡（38±4）歲，診斷均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)院修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)［13］。15例健康女性作為正常對照組，年齡（39±7）歲，均無風(fēng)濕病史和風(fēng)濕病家族史。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法測定血漿游離TNF－α水平：靜脈采血分離血清，－20℃貯存?zhèn)溆?。測定前，將樣本置于室溫中融化混勻，采用定量的酶聯(lián)免疫測定法（ELISA法）測定血漿中TNF－α水平。測定所使用的試劑購自美國R＆D Systems Inc和Sigma Inc，測定步驟按照試劑使用說明書操作。

1.2.2 引物設(shè)計及合成：檢索NCBI網(wǎng)站GenBank查詢?nèi)薎KK－β基因的mRNA序列，利用primer express軟件設(shè)計引物，IKKβ上游引物：5’－GGCAAACCGTAC－TCCAAGCAC－3’，下游引物：5’－CCTTGTCTGCACACTGGAGGTC－3’。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)：Trizol法抽提總RNA，用含反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTMRTase逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，－70℃保存。引物序列：在ABI Prism 7500測序儀（Applied Biosysterms公司）上以cDNA為模版利用DNA聚合酶TaKaRa EX TapTMHS進行實時定量PCR擴增反應(yīng)，具體操作參照SYBR PrimeScriptTMRT－PCR試劑盒說明書進行。

1.2.4 Western blot法檢測IKK－β蛋白表達水平：收集PBMC，加裂解液冰上振蕩裂解60min，12000r／min離心20min后取上清，－80℃保存。結(jié)果用Labwork凝膠圖像分析軟件對膠片掃描測定感光區(qū)帶的感光密度，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料用±s表示。按照患者與正常人分組進行方差齊性分析，方差齊性行獨立樣本t檢驗，方差不齊行Mann－Whitney秩和檢驗，直線相關(guān)分析判斷各指標(biāo)問的相關(guān)性，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 SLE患者與健康對照組外周血TNF水平比較：SLE患者外周血TNF－α水平（242.88±49.95pg／ml）顯著高于正常對照組（115.23±31.55pg／ml），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＝0.000）；

2.2 SLE患者與健康對照組外周血IKK－β表達水平比較：實時熒光定量PCR結(jié)果顯示SLE患者IKK－β基因表達水平（1.91±1.36）與正常對照組（1.89±2.38）相比無差異（p＝0.894），蛋白印跡實驗結(jié)果顯示SLE患者IKKβ蛋白表達水平較正常對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＝0.009）；

2.3 IKKβ表達水平和疾病活動性的相關(guān)性：SLE患者IKKβ蛋白表達水平與抗dsDNA抗體水平呈正相關(guān)（r＝0.342，P＝0.001），與抗核抗體呈正相關(guān)（r＝0.262，P＝0.005）。

3 討論

IKK－β是一種蛋白激酶，在NF－κB激活過程中扮演著重要的角色。當(dāng)IKK－β被高水平炎性因子TNF－α激活后，能引起IKKβ／NF－κB通路異?；罨瑥亩餞、B淋巴細胞的增殖、活化，調(diào)控炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達，并且能調(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生。為了進一步探討IKK－β在SLE中的作用和意義，本文研究了IKK－β與抗雙鏈DNA（dsDNA）和抗核抗體（ANA）的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SLE患者IKK－β的表達與dsDNA、ANA均呈正相關(guān)關(guān)系，提示IKK－β與SLE患者抗體的產(chǎn)生密切相關(guān)，阻抑IKK－β的活化或許有利于SLE的治療。

綜上所述，SLE患者血清TNF－α水平升高，能夠激活I(lǐng)KK－β，使其表達增加，異常活化NF－κB通路，參與了SLE的發(fā)病，并且IKK－β的表達與dsDNA、ANA水平密切相關(guān)。因此，IKK－β有望成為自身免疫性疾病治療的靶分子。

［1］Rahman A，Iscnberg DA.Systemic lupus erythematesus.N Eng J Med.2008，358：929－939

［2］Kumar KR，Li L，Yah M，et a1.Regulation of B cell tolerance by the lupus susceptibility gene Lyl08.Science，2006，312：1665－1669