劉 月，張宇飛，張亞坤，孫曉林，劉淑英，2＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

綿羊肺腺瘤病毒（Ovine pulmonary adenocarinoma，OPAV）是綿羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenomatosia，OPA）的病原，主要侵害肺臟［1-3］。該病的一個(gè)重要特點(diǎn)是，由于與外源性綿羊肺腺瘤病毒高同源性的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒的存在，在OPA病羊體內(nèi)未曾檢測(cè)到OPAV的循環(huán)抗體而不能用常規(guī)的血清學(xué)方法進(jìn)行診斷，因此抗原的檢測(cè)尤為重要［4-6］。env基因編碼反轉(zhuǎn)錄病毒的囊膜蛋白，位于反轉(zhuǎn)錄病毒粒子的表面，許多逆轉(zhuǎn)錄病毒的囊膜存在可產(chǎn)生中和性抗體的特異性抗原［7-8］。綿羊肺腺瘤病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒科β反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員之一，囊膜蛋白ENV在病毒粒子的表面，這一位置更利于囊膜蛋白的檢測(cè)［9］?？贵w是由B淋巴細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的，可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合。本文旨在基于已獲得的綿羊肺腺瘤病毒NM株env基因序列的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)分析綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的B細(xì)胞抗原表位，然后再篩選出具有合適優(yōu)勢(shì)表位的候選抗原，為研制有效的疫苗和制備特異的檢測(cè)抗體提供參考，對(duì)綿羊肺腺瘤的防控和檢測(cè)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

OPAV-NM囊膜蛋白的氨基酸來自于Gen-Bank，序列登錄號(hào)為JQ837489。

1.2 方法

1.2.1 OPAV-NM囊膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 應(yīng)用 Gamier＿Robson（http：／／fasta.bioch.virginia.edu／fasta-www2／fasta-www.cgi？rm=misc1）方法、SOPMA（http：／／npsa-pbil.ibcp.fr）方法和網(wǎng)絡(luò)服 務(wù) 器 PSIPRED （http：／／bioinf.cs.ucl.ac.uk／psipred）、Predictprotein （http：／／www.predictprotein.org）預(yù)測(cè)OPAV-NM囊膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 OPAV-NM囊膜蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè) 利用DNA Star軟件的Protean模塊，用Kyte-Doolittle方法對(duì)囊膜蛋白的疏水性進(jìn)行分析，用Emini方法預(yù)測(cè)囊膜蛋白的表面可能性，用Karplus-Schulz方法預(yù)測(cè)囊膜蛋白的柔性區(qū)域，以Jameson-Wolf方法綜合預(yù)測(cè)囊膜蛋白的B細(xì)胞抗原指 數(shù)。用 網(wǎng)絡(luò)服務(wù) 器 Bcepred（http：／／www.imtech.res.in／raghava／bcepred／bcepred-submission.html），IEDB （http：／／tools.immuneepitope.org／）和 ABCpred（http：／／www.imtech.res.in／raghava／abcpred／ABC-submission.html）預(yù)測(cè)囊膜蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列分析

利用DNA Star軟件分析推導(dǎo)的OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列與外源OPAV21（AF105220）、OPAVJS7（AF357971.1） 和 內(nèi) 源 enOPAV-20（EF680302）的囊膜蛋白氨基酸同源性分析和序列比對(duì)。雖然OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸序列為與enOPAV-20的同源性高達(dá)95.2%，但仍存在一個(gè)明顯的差異區(qū)段，為第548TLLGLGILVFIIIVVILIFPCLVRGMVRDFLKMRVEMLHMKYR591位氨基酸，該區(qū)段的enOPAV-20氨基酸序列有一段明顯的氨基酸序列缺失，也沒有外源性綿羊肺腺瘤病毒特有的YXXM基序（圖1）。

圖1 AF105220、AF357971、EF680302與OPAV-NM囊膜蛋白氨基酸同源性分析與序列比對(duì)Fig.1 The amino acid homology analysis and sequence distances of envelope protein of between AF105220，AF357971，EF680302and OPAV-NM

2.2 OPAV-NM囊膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

Gamier-Robson方法是通過計(jì)算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)［10］。用該方法預(yù)測(cè)OPAV-NM囊膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，在615個(gè)氨基酸中α螺旋占29.5%，β折疊占32.21%和β轉(zhuǎn)角占21.7%和無規(guī)則卷曲占19.2%個(gè)氨基酸，說明其二級(jí)結(jié)構(gòu)豐富，且分布相對(duì)均勻，在各β折疊單元之間存在長(zhǎng)短不一的轉(zhuǎn)角（圖2A）。SOPMA是通過多序列比對(duì)來預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)［11］。預(yù)測(cè)α螺旋占45.2%，β折疊占18.05%，β轉(zhuǎn)角占3.09%，無規(guī)則卷曲占33.66%（圖2B）。Predictprotein服務(wù)網(wǎng)站是歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室提供的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)網(wǎng)站，采用PHD神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)類型，并計(jì)算預(yù)測(cè)置信度［12］。預(yù)測(cè)囊膜蛋白615個(gè)氨基酸中α螺旋占40.98%，β折疊占12.68%，環(huán)結(jié)構(gòu)占46.34%，屬于混合型蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)殘基表面暴露超過16%的氨基酸占50.08%，兩個(gè)跨膜螺旋區(qū)383～400和550～570，與Gamier-Robson預(yù)測(cè)的α螺旋相符，胞內(nèi)區(qū)第1～382，571～615兩個(gè)區(qū)段，胞外區(qū)第401～549區(qū)段。PSIPRED服務(wù)網(wǎng)站采用雙層反饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通過對(duì)PST-BLAST搜索得到同源序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)［12］。預(yù)測(cè)α螺旋占53.65%，β折疊占36.26%，無規(guī)則卷曲占10.08%。雖然各種方法預(yù)測(cè)的α螺旋，β折疊，β轉(zhuǎn)角，無規(guī)則卷曲這些結(jié)構(gòu)所占比例不完全相同，但都提示蛋白質(zhì)OPAV-NM囊膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)豐富，同時(shí)OPAV-NM囊膜蛋白具有多處轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲區(qū)域，提示OPAV-NM囊膜蛋白具有較多的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)段。

圖2 A Gamier＿Robson法預(yù)測(cè)OPAV-NM囊膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 A Secondary structure of envelope protein of OPAV-NM predicted by Gamier＿Robson method

圖2 B SMOPA預(yù)測(cè)OPAV-NM囊膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 B Secondary structure of envelope protein of OPAV-NM predicted by SMOPA method

2.3 OPAV-NM囊膜蛋白的親水性（Hydrophilicity）分析

用Kyte-Doolittle方法對(duì)OPAV-NM囊膜蛋白的親水性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示該蛋白有兩個(gè)主要的疏水性區(qū)域，其位置是380～410和545～573，而且疏水性指數(shù)比較高，其中以囊膜蛋白的羧基端疏水性最高，提示可能為OPAV-NM囊膜蛋白的跨膜區(qū)。與Predictprotein預(yù)測(cè)的跨膜螺旋區(qū)相符（圖3）。

圖3 OPAV-NM囊膜蛋白的親水性分析Fig.3 Hydrophilicity for the envelope protein of OPAV-NM

2.4 OPAV-NM囊膜蛋白的表面可能性（Surface probability）分析

OPAV-NM囊膜蛋白的氨基酸呈現(xiàn)在表面可能性較大的區(qū)域主要是第167～180、第474～495、第640～615區(qū)段，其他部位展示的可能性較小或表現(xiàn)為負(fù)值（圖4）。

圖4 OPAV-NM囊膜蛋白的表面可能性分析Fig.4 Surface probability for the envelope protein of OPAV-NM

2.5 OPAV-NM囊膜蛋白的柔韌性（Flexible）分析

OPAV-NM囊膜蛋白骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域，且分布比較均勻，氨基端的柔韌性區(qū)域比羧基端相對(duì)分布多。提示該蛋白肽段的柔韌性較大，發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高，能形成豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5）。

圖5 OPAV-NM囊膜蛋白骨架的柔韌性分析Fig.5 Flexible regions for the envelope protein of OPAV-NM

2.6 OPAV-NM囊膜蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)分析

Bcepred是利用蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)B細(xì)胞抗原表位，IEDB是利用氨基酸殘基的理化性質(zhì)和在實(shí)驗(yàn)中已證明抗原發(fā)生頻率，研制開發(fā)的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)B細(xì)胞抗原表位的半經(jīng)驗(yàn)法，ABCpred是利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)B細(xì)胞抗原表位［13-16］。綜合DNA Star軟件的Protean模塊評(píng)價(jià)OPAVNM囊膜蛋白B細(xì)胞抗原表位，聯(lián)合以上蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，親水性，表面可能性和柔韌性的預(yù)測(cè)，分析OPAV-NM囊膜蛋白潛在優(yōu)勢(shì)的蛋白抗原決表位，結(jié)果顯示囊膜蛋白含有許多抗原指數(shù)好抗原性較高的區(qū)域，綜合分析結(jié)果為第52～76，101～110，118～165，182～196，201～215，281～305，309～332，335～356，461～476，530～574位，共10個(gè)區(qū)段為OPAV-NM囊膜蛋白潛在的優(yōu)勢(shì)抗原表位（圖6）。Predictprotein分析顯示第401～549區(qū)段位于胞外區(qū)，而預(yù)測(cè)的優(yōu)勢(shì)抗原表位第461～476位氨基酸序列和第530～574位的部分氨基酸序列正位于胞外區(qū)，en-OPAV和ex-OPAV的囊膜氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)第530～574區(qū)段位于的差異區(qū)，該段氨基酸序列對(duì)綿羊肺腺瘤病毒疫苗和診斷方法的研究有重要意義。

圖6 OPAV-NM囊膜蛋白的抗原指數(shù)分析與抗原性分析Fig.6 Antigenic index analysis and antigenicity analysis of the envelope protein of OPAV-NM

3 討論

有研究表明，組成蛋白的氨基酸種類與該蛋白形成α螺旋結(jié)構(gòu)的能力有關(guān)，例如，肽鏈中脯氨酸（Pro）或甘氨酸（Gly）的出現(xiàn)頻率較高，將不利于α螺旋結(jié)構(gòu)的形成［17］。OPAV-NM囊膜蛋白中Pro出現(xiàn)的頻率是5.8%，Gly出現(xiàn)的頻率是3.6%，相對(duì)較低，根據(jù)上述二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果分析OPAV-NM囊膜蛋白中α螺旋結(jié)構(gòu)所占比例在各種預(yù)測(cè)方法中最高，但是該蛋白也具有較多的β折疊，轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)區(qū)段，因此該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)豐富。蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲是比較松散的結(jié)構(gòu)，易于發(fā)生扭曲，盤旋并展示在蛋白的表面，因此該區(qū)域通常存在B細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)抗原表位［18］。

當(dāng)前疫苗學(xué)研制新型疫苗的一個(gè)研究熱點(diǎn)是利用基因工程技術(shù)，其基本技術(shù)思路是通過分析病毒的基因組序列來預(yù)測(cè)病毒的所有抗原信息，然后篩選出合適的候選抗原，進(jìn)而研制出有效的疫苗，這種研制 疫 苗 的 方 法 策 略 稱 為 “反 向 疫 苗 學(xué)”［19］。OPAV-NM囊膜蛋白分析結(jié)果表明，在該蛋白近氨基端的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)區(qū)域相對(duì)較多，并且這些區(qū)域的抗原指數(shù)和親水性指數(shù)較高，呈現(xiàn)在蛋白表面的幾率也比較大，因此該區(qū)段的抗原表位應(yīng)該是OPAV-NM囊膜蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位所在。研究表明OPAV囊膜蛋白可被OPAV-SU單抗識(shí)別，其中SU是OPAV囊膜蛋白的表面蛋白位于囊膜蛋白氨基端部分，與本文的預(yù)測(cè)結(jié)果相符［14］。尤其是第530～574位區(qū)域位于en-OPAV和ex-OPAV的囊膜氨基酸序列比對(duì)的差異區(qū)，且有部分氨基酸序列位于Predictprotein分析的胞外區(qū)（第401～549位），該段氨基酸序列對(duì)綿羊肺腺瘤病毒疫苗學(xué)和診斷方法的研究有重要意義。本次試驗(yàn)結(jié)果可作為ex-OPAV囊膜蛋白潛在的B細(xì)胞線性表位參考數(shù)據(jù)，在今后的ex-OPAV囊膜蛋白表位研究中，應(yīng)采用軟件預(yù)測(cè)結(jié)果與試驗(yàn)鑒定表位結(jié)合的方法對(duì)ex-OPAV囊膜蛋白的抗原表位加以鑒定，為今后OPAV反向疫苗學(xué)研究、多表位疫苗的研制、診斷試劑的制備及單克隆抗體的篩選提供科學(xué)的依據(jù)。

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