權(quán)自芳，劉 丹，楊紹林，張 蕾，顏其貴，2＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心，四川雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川雅安625014）

赤腹松鼠（Callosciurus erythraeus）屬于嚙齒目，松鼠科，棲息于熱帶、亞熱帶森林中，以針葉林、混交林較為常見，亦可在山崖甚至居民點附近活動，以植物的嫩葉、果實、種子為主食，亦食用各種農(nóng)作物［1］。赤腹松鼠對林木危害嚴重，是四川省主要的人工林害鼠之一［2-3］。隨著森林旅游業(yè)的發(fā)展，人類和家畜與森林野生動物接觸的機會和強度逐漸增大，赤腹松鼠數(shù)量巨大且分布廣泛，如果攜帶病原細菌，將會成為家養(yǎng)動物及人類某些疾病的傳染來源。細菌耐藥已成為一個全球性問題，幾乎所有細菌都能獲得耐藥基因，幾乎每一種抗菌藥物都能被細菌中某些物質(zhì)抵抗或破壞［4］，給臨床細菌性疾病的治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)，對人類健康構(gòu)成了嚴重的威脅，野生動物源的細菌的耐藥性的研究對細菌耐藥性機理的研究具有重要的意義。

本試驗以四川省某旅游景區(qū)的赤腹松鼠為對象，對赤腹松鼠所攜帶腸道細菌進行分離鑒定，探究是否有可致人獸患病的病原細菌及其能否危害旅游資源的開發(fā)利用；在分離鑒定赤腹松鼠腸道菌群的基礎(chǔ)上進行藥敏試驗，評定在未給藥狀態(tài)下這些細菌是否對某些抗生素產(chǎn)生耐藥性，為今后研究耐藥傳遞機制提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 四川省某旅游景區(qū)健康赤腹松鼠33只。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 Tryptone（OXOID Ltd.），Yeast Extract（OXOID Ltd.）購于Sigma公司；血瓊脂、SP瓊脂、DHL瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、MH培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司；質(zhì)粒小量抽提、凝膠回收試劑盒、Mix等購于天根生化技術(shù)有限公司；上游引物 、下游引物購于上海英俊生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料采集 采集赤腹松鼠小腸內(nèi)容物33份，具體采集、保存方法按參照文獻［5］進行。

1.2.2 細菌分離純化 挑取小腸內(nèi)容物分別于血瓊脂、SP瓊脂、DHL瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂劃線接種，37℃培養(yǎng)48h，再根據(jù)菌落形態(tài)、大小進行純化培養(yǎng)。根據(jù)平板上的菌落生長的形態(tài)、大小、顏色等進行分類，對每一類典型菌落進行革蘭染色鏡檢，初步區(qū)分革蘭陰性和陽性菌。再根據(jù)革蘭染色特性和菌體形態(tài)，初步判定細菌類屬，進行針對性純化培養(yǎng)。

1.2.3 16SrRNA鑒定 細菌分離純化后，抽提基因組DNA，利用16SrRNA細菌通用引物（上游引物：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′，下 游 引物：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′），進 行16SrRNA基因片段擴增。PCR擴增的反應(yīng)體系為：5μL10×EX Taqbuffer（Mg2＋Plus），4μL dNTP Mixture（各2.5mmol／L），1μL 下游引物（20μmol／L），1μL上游引物（20μmol／L），0.25μL TaKaRa EX Taq （5U／μL），5.0μL模板 DNA，33.75μL ddH2O。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95℃10min；95℃30s，53℃30s，72℃90s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7min［6］。

反應(yīng)完成后，取5μL擴增產(chǎn)物，10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。陽性PCR擴增產(chǎn)物回收純化送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 藥敏試驗 對鑒定的細菌進行藥敏試驗，采用美國臨床實驗室標準委員會CLSI推薦的K-B法進行操作。將分離鑒定的各種細菌挑取單個典型菌落接種于10mL LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h～24h，用無菌生理鹽水將旺盛生長的LB培養(yǎng)基的濁度調(diào)整到光學上相當于0.5麥氏標準（1×108cfu／mL），用無菌棉拭子蘸取含菌培養(yǎng)液，均勻涂布在MH平板培養(yǎng)基上，加蓋后室溫下放置10min，用無菌眼科鑷子將藥敏紙片輕輕貼于平板上，37℃培養(yǎng)16h～18h，測量抑菌圈直徑，結(jié)果判定依據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準進行。試驗所選擇藥物包括氨芐西林、阿莫西林（復(fù)方）、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢噻肟、阿米卡星、羅紅霉素、氟苯尼考、大觀霉素、林可霉素和泰妙菌素17種抗菌藥物。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定

本試驗從33只赤腹松鼠小腸內(nèi)容物中共分離鑒定出117株細菌，對分離菌株進行16SrRNA基因PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察，在1 500bp處均出現(xiàn)一條明亮的目的條帶（圖1）。將PCR產(chǎn)物回收純化，送往上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank中參考菌株16SrRNA基因核苷酸序列進行同源性分析比較，根據(jù)不同屬細菌16SrRNA基因同源性為70%～90% ，而同一種內(nèi)不同株間基因同源性大于99%的判定標準，表皮葡萄球菌、金色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、熒光假單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和Weihenstephanensis芽胞桿菌等分離菌株與GenBank中相關(guān)參考菌株16SrRNA基因的核苷酸序列同源性均在99%～100% 之間，從而鑒定出這些細菌的種屬。

圖1 16SrRNA PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of 16SrRNA

赤腹松鼠腸道所攜帶的細菌主要有腸桿菌屬、葡萄球菌屬、芽胞桿菌屬、腸球菌屬、克雷伯菌屬、假單胞菌屬、明串珠菌屬，其中大腸埃希菌32株、金黃色葡萄球菌28株、松鼠葡萄球菌16株、蠟樣芽胞桿菌14株、糞腸球菌11株、表皮葡萄球菌3株、Weihenstephanensis芽胞桿菌3株、肺炎克雷伯菌2株、枯草芽胞桿菌2株、蘇云金芽胞桿菌2株、Samanii芽胞桿菌2株、熒光假單胞菌1株、腸膜樣明串珠1株（表1）。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

對從赤腹松鼠腸道分離鑒定出的細菌進行K-B法藥敏試驗，結(jié)果表明，這些菌株對氟苯尼考、環(huán)丙沙星等藥物敏感，而對大觀霉素、氨芐西林等藥物不敏感（表2）。

表1 赤腹松鼠腸道中細菌鑒定結(jié)果及檢出數(shù)與檢出率Table 1 Identification results，and detection number and detection rate of isolated bacterial strains of intestine of Callosciurus erythraeu%

3 討論

細菌分離鑒定出117株，13種細菌，其中一些是可導(dǎo)致人畜患病的病原菌，如肺炎克雷伯菌、Weihenstephanensis芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、Samanii芽胞桿菌對人和動物都有一定的危害，其中蠟樣芽胞桿菌在細菌性食物中毒中比較常見，占全部食物中毒事件的4.0%，在細菌性食物中毒據(jù)第4位［7］。而肺炎克雷伯菌是人類呼吸道和腸道的常居菌，可引起下呼吸道、泌尿道、消化道、手術(shù)切口、血液、顱內(nèi)和皮膚軟組織等多個部位感染，是醫(yī)院感染和免疫缺陷者感染的重要病原菌。

表2 赤腹松鼠腸道分離菌株藥敏試驗結(jié)果Table 2 Drug susceptibility test of the isolated bacterial strains of intestine of Callosciurus erythraeus

另一些為潛在的條件致病菌，在動物機體抵抗力下降、飼養(yǎng)環(huán)境改變或運輸?shù)葢?yīng)激反應(yīng)情況下可使動物發(fā)病甚至死亡，如表皮葡萄球菌在通常情況下不會致病，一般只在藥物濫用者，接受免疫抑制治療的病人，艾滋病病人和早產(chǎn)兒等免疫低下的個體中引起感染，是一種機會致病菌［8］，同時它也是人體皮膚以及黏膜表面常見的寄生菌，在這些部位分離到的葡萄球菌約占65%～90%。表皮葡萄球菌是醫(yī)院感染中最常見的病原菌，也是引起醫(yī)院內(nèi)生物材料相關(guān)性感染的重要致病菌，主要在免疫力受損人群中容易引起感染，特別是在使用高分子材料留置物的病人中通過在體內(nèi)留置物這類醫(yī)學材料表面形成生物膜致病，表皮葡萄球菌致病機理與其能黏附在高分子材料表面并形成生物膜有關(guān)。大腸埃希菌通常情況下為腸道正常菌群，在飼養(yǎng)管理不良、衛(wèi)生條件差、環(huán)境溫差變化等綜合應(yīng)激因素下引起仔豬抵抗力降低，可誘發(fā)仔豬黃痢和白痢等。

其中也存在對生態(tài)有益的細菌，例如，熒光假單胞菌，它對于植物病害，特別是土傳病害如根腐病、猝倒病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一種重要的有益微生物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的意義；而蘇云金芽胞桿菌是目前世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的一種生防微生物，對人畜及非靶標昆蟲無害，具有巨大的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值［9］。而其他大部分菌株都是動物體內(nèi)正常的有益菌群，如枯草芽胞桿菌、糞腸球菌、腸膜樣明串珠菌等。

藥敏試驗結(jié)果中金黃色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌對大觀霉素耐藥；蠟樣芽胞桿菌對氨芐西林、阿莫西林、羅紅霉素、大觀霉素耐藥；克雷伯菌對氨芐西林耐藥；蘇云金芽胞桿菌、Weihenstephanensis芽胞桿菌、Samanii芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌對氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素耐藥，這些與其他家養(yǎng)動物細菌耐藥情況有所不同［10-12］。

臨床中抗生素的使用，使細菌耐藥出現(xiàn)及蔓延，而赤腹松鼠在未給藥狀態(tài)下腸道部分細菌所產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)非抗生素誘導(dǎo)的結(jié)果。對于旅游景區(qū)而言，每個游客都是一個潛在的污染源，尤其一些缺乏生態(tài)環(huán)保意識的旅游者的不文明行為，給景區(qū)環(huán)境造成嚴重污染與破壞［13］。所產(chǎn)生旅游垃圾的成分比較復(fù)雜，大致可以分為兩類，即有機垃圾和無機垃圾，無機垃圾包括各類塑料制品和包裝物，還有口香糖、碎磚、石塊煤灰、煙頭、灰土、爐渣、廢紙等；有機垃圾包括畜禽糞便、動物尸體、剩茶剩飯、瓜果皮核、菜根菜葉、魚肉骨頭、蛋殼和樹葉雜草等，以及由于沒有完善的旅游設(shè)施而在野外四處散布游客的糞便。當活動于旅游景區(qū)的赤腹松鼠與這些旅游垃圾接觸，可能將畜禽及人類具有耐藥基因細菌攝入體內(nèi)，細菌間耐藥基因（質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等）進行轉(zhuǎn)移，使其它細菌獲得耐藥基因，這為赤腹松鼠在未給藥狀態(tài)下腸道部分細菌產(chǎn)生耐藥性的可能原因。

本研究以四川省某旅游景區(qū)的赤腹松鼠為對象，對赤腹松鼠所攜帶腸道細菌進行分離鑒定，結(jié)果表明，赤腹松鼠腸道細菌種群具有多樣性，且存在致病菌，這為研究野生動物是否攜帶致病菌提供了參考。在分離鑒定松鼠腸道菌群的基礎(chǔ)上進行藥敏試驗，結(jié)果表明，赤腹松鼠腸道部分細菌具有耐藥性，這為進一步研究細菌攜帶的天然耐藥基因以及耐藥傳遞機制提供了素材。同時也為旅游環(huán)境的保護，提出了警示和建議，為更好、更安全的發(fā)展以野生動物為對象的休閑旅游娛樂活動和森林旅游活動提供一定的參考。

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