張 斌，湯 承，岳 華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）是豬上呼吸道的一種共棲菌，可在特定條件下侵入機(jī)體引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征。副豬嗜血桿菌病在世界上許多養(yǎng)豬國(guó)家廣泛存在，已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾?。?］。

外膜是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的特有結(jié)構(gòu)，它位于細(xì)菌胞漿膜和肽聚糖層的外側(cè)，包圍整個(gè)細(xì)菌，具有典型的非對(duì)稱性的磷脂雙層結(jié)構(gòu)。位于外膜上的蛋白總稱為外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）［2］。在革蘭陰性菌中，OMP在細(xì)菌致病和免疫具有一定的聯(lián)系。在H.parasuis中，OMP是潛在的毒力因子也具有良好的免疫源性。Ruiz A等［3］比較了從發(fā)病豬的實(shí)質(zhì)器官和健康動(dòng)物的上呼吸道分離的不同H.parasuis的OMP型，發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE電泳圖譜上有6個(gè)～7個(gè)分子質(zhì)量不同外膜蛋白。發(fā)現(xiàn)36.3ku～38.5ku OMP只在發(fā)病豬中分離菌株存在，而在健康動(dòng)物的上呼吸道分離株中是缺失的，因此推測(cè)該分子量范圍的OMP可能與毒力相關(guān)。在免疫方面，Miniats O P等［4］證明免疫豬的血清中只有針對(duì)OMP的抗體而不存在針對(duì)脂多糖和莢膜多聚糖的抗體，這證明了OMP具有較強(qiáng)的免疫原性。Fuente A J等［5］用H.parasuis的OMP作為疫苗免疫豬，能對(duì)同型菌株的攻擊產(chǎn)生部分保護(hù)作用，證明OMP中存在保護(hù)性抗原。但具體是外膜蛋白的哪一組分尚不清楚。Zhou M等［6］利用蛋白組學(xué)方法在H.parasuis SH0165菌株的OMP中尋找能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpP2、D15、PalA 和 HPS-06257能產(chǎn)生相對(duì)高的保護(hù)力，這就暗示這4個(gè)蛋白能作為潛在的疫苗抗原。

H.parasuis參考菌株29755和分離株SH0165的基因組已經(jīng)公布，但絕大多數(shù)基因的功能還不清楚。從2個(gè)基因組中都發(fā)現(xiàn)了6個(gè)編碼主要外膜蛋白的基因，這些基因在細(xì)菌的感染與免疫中發(fā)揮的具體作用還不清楚。本文對(duì)H.parasuis 6個(gè)主要的OMP基因特點(diǎn)和潛在功能進(jìn)行綜述。

1 外膜蛋白P1基因與編碼的蛋白

外膜蛋白 P1（outer membrane protein P1，OmpP1）屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。分離株SH0165的OmpP1基因長(zhǎng)1 290bp，編碼429個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量46.02ku。H.parasuis與其他巴斯德菌科細(xì)菌相比，如肺炎胸膜放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）、杜克雷嗜血桿菌（Haemophilus ducreyi）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）和睡眠嗜血桿菌（Haemophilus somnus）等基因同源性為47.2%～53.3%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明H.parasuis的OmpP1基因單獨(dú)聚為一支，并與肺炎胸膜放線桿菌、杜克雷嗜血桿菌的親緣關(guān)系較近（圖1）。

在流感嗜血桿菌，OmpP1約占外膜蛋白的10%，是一個(gè)保護(hù)性抗原。OmpP1抗體在小鼠動(dòng)物模型中有良好的保護(hù)力［7-8］。在流感嗜血桿菌中，OmpP1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)8個(gè)潛在的表面暴露環(huán)，其中4個(gè)表面暴露的環(huán)已證實(shí)具有免疫功能［9］。比對(duì)流感嗜血桿菌OmpP1蛋白的研究，我們預(yù)測(cè)H.parasuisOmpP1也可能是一個(gè)疫苗候選抗原。

圖1.H.parasuis與其他巴斯德菌科細(xì)菌的OmpP1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 The phylogenetic tree analysis of OmpP1gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

2 外膜蛋白P2基因與編碼的蛋白

外膜蛋白P2（outer membrane protein P2，OmpP2）屬微孔蛋白，在15個(gè)血清型參考菌株中OmpP2基因長(zhǎng)度為1 077bp～1 203bp，編碼358個(gè)～400個(gè)氨基酸，編碼蛋白大小為38.49ku～43.35ku，不同血清型之間氨基酸同源性為83.9%～99.4%，與其他巴斯德菌科細(xì)菌相比氨基酸之間的同源性為28.7%～42.1%。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)H.parasuisOmpP2基因單獨(dú)聚為一支，并與肺炎胸膜放線桿菌、小放線桿菌的親緣關(guān)系較近（圖2）。

圖2 H.parasuis與其他巴斯德菌科細(xì)菌的OmpP2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 The phylogenetic tree analysis of OmpP2gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

微孔蛋白常以非共價(jià)鍵與肽聚糖、脂多糖緊密結(jié)合，可形成相對(duì)非特異性的通道或透道，具有通透性［10］。在革蘭陰性細(xì)菌中，微孔蛋白不但具有維持細(xì)胞膜的通透性和穩(wěn)定性等功能，還參與細(xì)菌的致病過(guò)程，如黏附、入侵、抵抗補(bǔ)體殺菌和促進(jìn)炎癥反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)OmpP2在H.parasuisOMP中的含量最為豐富［6］，也是受關(guān)注度最高的外膜蛋白。Zhou M等［6］用重組的OmpP2蛋白免疫注射小鼠后，用5LD50的SH0165菌株攻毒可產(chǎn)生80%保護(hù)率。Mullins M A 等［11］發(fā) 現(xiàn)H.parasuisOmpP2蛋白的序列具有豐富的遺傳多樣性，這種序列異質(zhì)性可能與宿主的免疫壓力相關(guān)，也可能與菌株的毒力有一定的聯(lián)系。趙倩等［12］發(fā)現(xiàn)H.parasuisOmpP2基因存在兩種結(jié)構(gòu)類型，即參考菌株血清型為2、4、5、10、12、13、14和15的菌株中 OmpP2基因存在兩處連續(xù)堿基缺失，而參考菌株血清型為1、3、6、7、8、9和11的菌株中OmpP2基因沒(méi)有出現(xiàn)缺失，暗示這種缺失現(xiàn)象主要出現(xiàn)在強(qiáng)毒力血清型的菌株中，OmpP2基因有可能是區(qū)分H.parasuis強(qiáng)、弱毒力菌株的分子靶標(biāo)。Zhang B等［13］構(gòu)建了血清4型分離株的OmpP2基因缺失株，研究發(fā)現(xiàn)缺失株生長(zhǎng)緩慢和對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌作用敏感性增加。另外，發(fā)現(xiàn)具堿基缺失型OmpP2蛋白的H.parasuis更能抵抗補(bǔ)體殺菌的作用。OmpP2基因的缺失還表現(xiàn)出對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞黏附能力和細(xì)胞外的生存能力下降。同時(shí)，從SC096菌株提取純化的OmpP2蛋白也能介導(dǎo)對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的黏附作用［14］。以上結(jié)果表明H.parasuisOmpP2是一個(gè)免疫保護(hù)性蛋白，在維持細(xì)菌生長(zhǎng)、抵抗血清中補(bǔ)體殺菌作用和對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用中發(fā)揮著重要的作用。

3 表面抗原D15基因與編碼的蛋白

H.parasuis表面抗原D15（surface antigen D15）屬于微量外膜蛋白。SH0165的D15基因長(zhǎng)1734bp，編碼577個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為66.23ku，與其他巴斯德菌科細(xì)菌的表面抗原D15的同源性為47.3%～57.1%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，H.parasuisD15基因單獨(dú)聚為一支，與肺炎胸膜放線桿菌、杜克雷嗜血桿菌的親緣關(guān)系較近（圖3）。

圖3 H.parasuis與其他巴斯德菌科細(xì)菌的D15基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis of D15gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

在革蘭陰性菌中，微量外膜蛋白雖含量低，但發(fā)揮著重要的作用。在H.parasuis中，D15蛋白被認(rèn)為是候選疫苗抗原。用重組的D15蛋白免疫小鼠，攻毒后能產(chǎn)生60%的保護(hù)率［6］。在流感嗜血桿菌中，D15蛋白也是一個(gè)保護(hù)性抗原［15］。研究發(fā)現(xiàn)b型流感嗜血桿菌D15重組蛋白不僅與不同血清型的菌株，也可以與副流感嗜血桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)，純化的重組D15蛋白抗體對(duì)小鼠的菌血癥具有保護(hù)作用。

4 外膜蛋白26基因與編碼的蛋白

H.parasuis外膜蛋白26（outer membrane protein 26，OmpP26）屬于外膜蛋白H家族（outer membrane protein H，OmpH）。SH0165 的OmpP26基因長(zhǎng)804bp，編碼267個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為29.76ku。OmpP26與同源的Skp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、OmpH蛋白高度保守［16-17］。多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌、杜克雷嗜血桿菌等均具有OmpH家族的外膜蛋白，且在氨基酸同源性為37.6%～54.5%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明H.parasuis的OmpP26基因單獨(dú)聚為一支，并與肺炎胸膜放線桿菌、杜克雷嗜血桿菌的親緣關(guān)系較近（圖4）。

圖4 H.parasuis與其他巴斯德菌科細(xì)菌的OmpP26基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 The phylogenetic tree analysis of OmpP26gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

在流感嗜血桿菌中，OmpP26位于遺傳結(jié)構(gòu)的一個(gè)高度保守區(qū)域，并且在革蘭陰性細(xì)菌中的同源序列也是高度保守的，表明該蛋白具有重要的功能。通過(guò)氣管免疫小鼠模型研究表明，OmpP26能夠顯著增強(qiáng)肺對(duì)不定型的流感嗜血桿菌的清除率［17］。OmpP26經(jīng)黏膜途徑免疫小鼠后，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。同型或異型的菌株攻擊免疫了動(dòng)物時(shí)，顯著增強(qiáng)了攻毒4h后的肺臟內(nèi)細(xì)菌清除率。缺少信號(hào)肽序列的OmpP26重組蛋白能引起支氣管肺泡灌洗液和免疫血清中IgG和IgA抗體滴度顯著增加；而具有信號(hào)肽序列的OmpP26重組蛋白在增強(qiáng)肺清除率上更有效，能夠介導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)［18］。此外，OmpP26重組蛋白介導(dǎo)較高的全身性和黏膜抗體的總體水平，與提取的天然蛋白介導(dǎo)的抗體水平相當(dāng)［16］。

5 鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白基因與編碼的蛋白

H.parasuis鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白（iron-regulated outer membrane protein，Iron-regulated OMP）也屬于OmpH。Iron-regulated OMP基因長(zhǎng)2 394 bp，編碼797個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為90.68ku。與其他巴斯德菌科細(xì)菌的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白基因同源性為38%～56.3%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，H.para-suis的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白基因單獨(dú)聚為一支，并與肺炎胸膜放線桿菌和溶血性曼氏桿菌的親緣關(guān)系較近（圖5）。

圖5 H.parasuis與其他巴斯德菌科細(xì)菌的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 The phylogenetic tree analysis of Iron-regulated OMP gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

鐵離子是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖必需的營(yíng)養(yǎng)因子之一。Keumhwa C K等［19］研究發(fā)現(xiàn)一些病原菌之所以能在宿主體內(nèi)增殖，是因?yàn)橄掼F條件迫使細(xì)菌產(chǎn)生高親和性的攝鐵系統(tǒng)，主要有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、乳鐵蛋白受體及鐵載體等［20］，其與宿主競(jìng)爭(zhēng)攝取鐵離子復(fù)合物，從而獲取鐵以滿足自身代謝需要。這些蛋白僅在限鐵條件下表達(dá)，故被稱為鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白。研究表明溶血性曼氏桿菌，牛、禽及豬多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌及腦膜炎奈瑟氏菌等在限鐵條件下均能表達(dá)這些蛋白。禽多殺性巴氏桿菌和豬多殺性巴氏桿菌在體內(nèi)增殖時(shí)表達(dá)的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白具有交叉免疫保護(hù)作用［21］。兔多殺性巴氏桿菌在限鐵條件下表達(dá)的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白也具有交叉免疫原性［22］。在小鼠模型上，比較了兔多殺性巴氏桿菌鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白的免疫原性及交叉免疫保護(hù)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白組的抗體滴度＞外膜蛋白組的抗體滴度＞全菌組的抗體滴度。小鼠在被動(dòng)免疫后攻毒，鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白組具有很好的保護(hù)力，同時(shí)也具有一定的交叉保護(hù)力［23］。

6 外膜蛋白P5基因與編碼的蛋白

外膜蛋白 P5（outer membrane protein P5，OmpP5）屬于外膜蛋白A家族。參考菌株27955全基因組中的OmpP5基因長(zhǎng)1 104bp，編碼367個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為39.5ku。OmpP5蛋白的前21個(gè)氨基酸殘基組成信號(hào)肽，成熟的OmpP5由346個(gè)的氨基酸組成，預(yù)測(cè)蛋白的分子質(zhì)量為37.48ku。而SH0165的OmpP5基因長(zhǎng)1 119bp，編碼372個(gè)氨基酸，說(shuō)明了相同的血清型存在不同基因長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。H.parasuis血清4、5型的參考菌株與其他巴斯德菌科菌株相比，如海藻巴斯德菌、葡萄糖曼海姆菌、豬放線桿菌、溶血曼海姆菌、溶血性巴氏桿菌、杜克雷嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌，OmpP5氨基酸同源性為54.2%～74.8%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，H.parasuis血清4、5型的OmpP5基因單獨(dú)聚為一支，并與海藻巴斯德菌的親緣關(guān)系最近（圖6）。

圖6 H.parasuis與其他巴斯德菌科細(xì)菌的OmpP5基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.6 The phylogenetic tree analysis of OmpP5gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

外膜蛋白A家族又稱熱修飾蛋白（heat-modifiable protein），在革蘭陰性菌的分子質(zhì)量大約34ku～36ku。OmpA是革蘭陰性菌外膜中的主要成分并具有保守性，其主要作用是維持外膜的完整，缺少OmpA和胞壁脂蛋白的細(xì)菌變異株其形態(tài)為球形，細(xì)胞膜也不穩(wěn)定［24］。此外該蛋白還有黏附、入侵、參與生物被膜的形成、抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)血清的殺傷和作為不同噬菌體的受體等功能。Tadjine M等［25］報(bào)道了H.parasuis的一個(gè)35ku MOMP，其N-端前12個(gè)氨基酸（-APQADSFYVGAK-）的同源性表明該蛋白可能為OmpA；而且該蛋白的單克隆抗體能與15個(gè)血清型和大量的分離株發(fā)生反應(yīng)，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明該蛋白為檢測(cè)H.parasuis的感染提供了一個(gè)良好的診斷抗原。Zhang B等［26］根據(jù)N-端前12個(gè)氨基酸序列，克隆血清4，5型的OmpP5基因并在大腸埃希菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組的OmpP5能與15個(gè)血清型的血清發(fā)生交叉反應(yīng)。也證實(shí)了OmpP5重組蛋白有潛力開(kāi)發(fā)一種針對(duì)廣譜血清型的診斷工具。為了進(jìn)一步研究H.parasuis其他血清型的OmpP5基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，Tang C等［27］克隆了H.parasuis其他13個(gè)參考菌株和20個(gè)臨床分離株的OmpP5基因。結(jié)果表明35株H.parasuis ompP5基因的完整編碼區(qū)有3個(gè)不同的長(zhǎng)度，1 098、1 104、1 110bp，平均變異率12.6%。OmpP5二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明H.parasuis OmpP5含有4個(gè)高變區(qū)，且又位于4個(gè)推測(cè)的表面暴露的環(huán)內(nèi)。根據(jù)OmpP5基因序列的差異，將35個(gè)菌株劃分為17個(gè)序列型（STA-Q），其中STA為臨床分離株的優(yōu)勢(shì)基因型。在20個(gè)臨床分離株中，血清分型與OmpP5STs分型的結(jié)果存一定的相關(guān)性，即優(yōu)勢(shì)STA基因型菌株包括了優(yōu)勢(shì)的血清5型菌株和不能分型的菌株。與血清分型相比，OmpP5基因ST分型能對(duì)臨床分離菌株提供更詳細(xì)的菌株分類信息。在H.parasuis SC096菌株中，當(dāng)缺失了OmpP5基因，細(xì)菌的生長(zhǎng)能力受到了明顯的影響。但野生菌株和缺失株的其他方面的表型，包括對(duì)豬和兔血清的殺菌作用、對(duì)PK-15和PUVEC的黏附入侵能力都沒(méi)有明顯的變化［28］。另外，OmpP5預(yù)測(cè)的成熟蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為36.3ku，位于與毒力相關(guān)的外膜蛋白分子質(zhì)量的范圍內(nèi)，OmpP5是否與毒力有某種聯(lián)系有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

7 問(wèn)題和展望

隨著H.parasuis全基因組測(cè)序的完成，人們開(kāi)始逐漸認(rèn)識(shí)了不同的外膜蛋白基因特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)。但是具體的功能作用和其他血清型的外膜蛋白基因和結(jié)構(gòu)特征還不是很清楚，還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。隨著新技術(shù)和新方法的不斷發(fā)展，分析鑒定H.parasuis基因功能的方法越來(lái)越多。重要的是遺傳操作自然轉(zhuǎn)化方法的建立和基因缺失株的構(gòu)建，對(duì)外膜蛋白的功能鑒定提供了技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)，了解各種外膜蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和具體的功能，鑒定具有保護(hù)作用的外膜蛋白，為開(kāi)發(fā)H.parasuis OMP亞單位疫苗提供了理論基礎(chǔ)，對(duì)H.parasuis的防治具有重要的意義。

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