曾少靈，廖立珊，唐金明，楊俊興，阮周曦，張彩虹，曹琛福，呂建強，秦智鋒，林慶燕，孫 潔，葉弈優(yōu)，謝曉露，花群義＊

（1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045；2.深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東深圳518045）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種急性、高度接觸傳染性疾病。ASFV是一種蟲媒性DNA病毒，僅有一個血清型，但有多個毒力差別的病毒株［1］。非洲豬瘟臨床癥狀是高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血、呼吸障礙、神經(jīng)癥狀，病程短，病死率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害很大，可造成毀滅性的嚴(yán)重后果，受到世界各國的高度重視［1］。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，在我國則列為一類動物疫?。?］。

1921年，ASF在肯尼亞被首次發(fā)現(xiàn)，此后在非洲、歐洲和美洲等地的數(shù)10個國家發(fā)生和流行，由于非洲國家部分地區(qū)的社會動亂和缺少疫病上報制度，目前ASF流行的實際狀況比上報的信息可能要嚴(yán)重得多［1-3］。OIE疫情公告中，俄羅斯自2011年以來幾乎每個月均有暴發(fā)ASF疫情，每次暴發(fā)均導(dǎo)致上萬頭豬死亡或被撲殺，對豬養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失［4-5］，同時對包括我國在內(nèi)的與其接壤的周邊國家和地區(qū)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，對我國防控ASF的傳入敲響了警鐘［6］。

ASFV VP73基因全長1 188bp，編碼的VP73蛋白是ASFV的主要抗原性結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，且抗原性極為穩(wěn)定，目前常被用作ELISA和Western blot檢測ASFV血清抗體的主要抗原［1］。我國目前未發(fā)現(xiàn)ASF，作為防控監(jiān)測使用的商業(yè)檢測試劑盒基本上需從國外引進(jìn)，檢測技術(shù)依賴國外，檢測成本昂貴，試劑購置周期長，一定程度上限制了我國監(jiān)測ASF的力度和效果。本研究在昆蟲細(xì)胞中實現(xiàn)了VP73蛋白的真核表達(dá)，獲得了免疫原性良好的重組蛋白，為ASF的免疫血清學(xué)診斷試劑制備及監(jiān)測技術(shù)儲備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸埃希菌（E.coli）DH5α、DH10Bac和載體pFastBac HTA、pFastBac HTCAT均為Invitrogen公司產(chǎn)品；載體pMD18-T為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pBAD-VP73（含ASFV全長VP73基因，大小1 188bp）和昆蟲細(xì)胞Sf9均為深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心動物檢疫實驗室保存。

1.1.2 試劑 非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清由英國動物衛(wèi)生研究所（IAH）Pribright實驗室惠贈；豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒（2型）病和豬細(xì)小病毒病等豬陽性血清均為深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心動物檢疫實驗室保存；各種酶、核酸提取試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；Cellfectin○RⅡ Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒、InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白膠染色試劑盒、抗豬IgG-HRP、Sf-900ⅡSFM培養(yǎng)基等購自Invitrogen公司；引物合成、DNA測序由Invitrogen公司完成。

1.1.3 儀器 ABI Veriti 96well Thermal Cycler型PCR儀，BioRad Universal HoodⅡ凝膠成像儀，Eppendorf 5415R型高速離心機，CTC-256型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，MA100型核酸／蛋白計數(shù)儀，I MARK型自動酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA-VP73的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中ASFV VP73基因序列，設(shè)計引物 primer F（EcoRⅠ）5′-G GAATTC ATGGCATCAGGAGGAG-3′和 primer R（PstⅠ）5′-A CTGCAG TTATGGTTTAAAGCGTAT-3′，擴(kuò)增pBAD-VP73質(zhì)粒中的全長VP73基因，將擴(kuò)增片段克隆至pMD18-T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，37℃培養(yǎng)16h，挑取陽性菌落，提取重組轉(zhuǎn)座載體pMD18TVP73ZH送公司測序。通過EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切，將擴(kuò)增片段從pMD18T-VP73ZH質(zhì)粒中切出并定向插入轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，37℃培養(yǎng)24h，挑取陽性菌落，提取重組質(zhì)粒pFastBac HTA-VP73，以酶切和PCR方法進(jìn)行鑒定。

1.2.2 重組表達(dá)載體Bacmid-VP73的構(gòu)建 將重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA-VP73轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac，涂于含 X-gal、IPTG、慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素的篩選平板上，37℃培養(yǎng)48h，挑取白色菌落。同時將pFastBac HT-CAT和pFastBac HTA進(jìn)行上述操作，分別作為陽性和陰性對照。提取重組Bacmid DNA （Bacmid-VP73、Bacmid-pFast-Bac HT-CAT 和 Bacmid-pFastBac HTA），使 用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作手冊推 薦 的 引 物 （pUC／M13Forward：5′-CCCAG TCACG ACGTT GTAAA ACG-3′，pUC／M13Reverse：5′-AGCGG ATAAC AATTT CACAC AGG-3′）進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.3 重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞Bacmid-vp73、Bacmid-pFastBac HT-CAT 和 Bacmid-pFastBac HTA經(jīng)脂質(zhì)體化處理后，分別轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，同時設(shè)置細(xì)胞空白對照，28℃培養(yǎng)3d，收集培養(yǎng)上清（含有重組桿狀病毒）。上清物再感染正常Sf9細(xì)胞，通過顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，一般36h～48h內(nèi)出現(xiàn)病變現(xiàn)象，至大約72h有超過80%的細(xì)胞發(fā)生明顯病變，此時收集細(xì)胞。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blot檢測 分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，確定表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的存在形式。分別以六組氨酸抗體和非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)血清抗體對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot檢測，確定目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)情況和抗原性。

1.2.5 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）的建立經(jīng)SDS-PAGE檢測確定表達(dá)產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞內(nèi)。以pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）懸浮清洗細(xì)胞，4 000r／min離心10min收集細(xì)胞。重復(fù)清洗1次～2次。以ELISA包被液重新懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融3次～5次后，以ELISA包被液稀釋成不同濃度的裂解液，以核酸／蛋白計數(shù)儀測定裂解液中的蛋白濃度。分別取50μL裂解液包被ELISA板，4℃過夜。用洗液清洗1次，封閉液37℃封閉2h，清洗2次，備用。分別對ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清按1∶100、1∶200、1∶400和1∶800進(jìn)行稀釋，與豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒（2型）病和豬細(xì)小病毒病等豬陽性血清一起作為待測樣品，采用包被好的ELISA板進(jìn)行ASFV血清抗體的iELISA檢測。加入各種血清樣品后，37℃孵育45min，洗板4次，加入羊抗豬IgG為二抗，37℃孵育30min，顯色，測定OD450nm值。

2 結(jié)果

2.1 ASFV VP73基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒pMD18T-VP73ZH的鑒定

從pBAD-VP73重組質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得全長VP73基因，上下游分別含有EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點，將片段克隆至pMD18-T質(zhì)粒中。對重組質(zhì)粒pMD18T-vp73ZH進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明含有ASFV VP73基因的完整讀碼框，基因上下游兩端帶有EcoRⅠ和PstⅠ酶切識別序列。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后進(jìn)行凝膠電泳檢測，可見大小約1 200bp的特異性條帶，大小與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA-VP73的鑒定

采用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切定位插入的方式，將目標(biāo)片段從pMD18T-VP73ZH重組質(zhì)粒中切出并定向定點插入載體pFastBac HTA的強啟動子下游，保證了插入基因的堿基精確對框，在表達(dá)時不發(fā)生錯配，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA-VP73。以引物對primerF和primerR對pFastBac HTA-VP73進(jìn)行PCR鑒定。另根據(jù)酶切圖譜分析結(jié)果，對pFastBac HTA-VP73分別進(jìn)行EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切、SpeⅠ單酶切和HindⅢ單酶切鑒定。上述處理后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，所得片段大小均與預(yù)期一致（圖2），表明重組轉(zhuǎn)座載體pFast-Bac HTA-VP73結(jié)構(gòu)組成正確。

圖1 重組質(zhì)粒pMD18T-VP73ZH的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pMD18T-VP73ZH

2.3 重組表達(dá)載體Bacmid-VP73的鑒定

分別用引物組primerF、primerR和pUC／M13 Forward、pUC／M13Reverse對Bacmid-VP73、Bacmid-CAT和Bacmid-HTA進(jìn)行PCR鑒定，對產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。前者PCR中，只在Bacmid-VP73為模板的PCR反應(yīng)中出現(xiàn)了VP73基因1200bp的片段，而未插入VP73基因的Bacmid-CAT和Bacmid-HTA均沒有，與預(yù)期一致（圖3 A）。后者 PCR 中，Bacmid-VP73、Bacmid-CAT 為模板的PCR反應(yīng)中分別出現(xiàn)了大約3 600bp和3 000bp的片段，與預(yù)期一致（圖3B）。

圖2 pFastBac HTA-VP73的PCR和酶切鑒定結(jié)果Fig.2 PCR and enzyme digestion identification of pFastBac HTA-VP73

圖3 Bacmid-VP73的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of Bacmid-VP73

2.4 重組桿狀病毒Bacmid-VP73轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9的病變情況

將重組桿狀病毒Bacmid-VP73轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，同時設(shè)立Bacmid-pFastBac HT-CAT作陽性對照、Bacmid-pFastBac HTA作陰性對照，以及細(xì)胞空白對照，72h后觀察細(xì)胞病變情況。與空白對照細(xì)胞組比較，發(fā)生病變的細(xì)胞組細(xì)胞數(shù)量明顯較少，生長緩慢甚至停滯，細(xì)胞個體膨脹，體積變大，胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒物，部分細(xì)胞發(fā)生破裂、溶解。

2.5 SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果

分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測，結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白主要存在于細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)上清中可檢測到少量重組蛋白。SDS-PAGE電泳后，蛋白膠先使用InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白膠染色試劑盒（按試劑盒操作說明書）對蛋白膠進(jìn)行染色。該試劑盒的染液中含有六組氨酸抗體，可以與帶有六組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白結(jié)合，并在紫外光照射下發(fā)出亮光，該試劑盒的檢測靈敏度與使用六組氨酸抗體進(jìn)行的Western blot轉(zhuǎn)膜雜交相當(dāng)，由于操作簡便和穩(wěn)定性好，該檢測方法目前已被廣泛采用。在紫外光照射下，可見65ku和26ku 2個明顯亮帶（圖4B），大小分別與VP73重組蛋白和陽性對照CAT蛋白的預(yù)期大小相符。

再以考馬斯亮藍(lán)對蛋白膠進(jìn)行染色，有同樣大小的2條表達(dá)條帶（圖4A）。

結(jié)果表明VP73重組蛋白和CAT陽性對照蛋白均在昆蟲細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)，且均帶有6組氨酸標(biāo)簽。

采用非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)血清對重組VP73蛋白進(jìn)行Western blot檢測，只在65ku處出現(xiàn)特異性印跡條帶（表達(dá)產(chǎn)物有部分降解，因此印跡條帶有拖尾現(xiàn)象），CAT陽性對照蛋白處沒有印跡條帶（圖5）。表明昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)的VP73蛋白能被相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)血清所識別，具有良好的反應(yīng)原性。

2.6 非洲豬瘟間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）的初步建立

按方法1.2.5制備了蛋白濃度分別為64、32、16、8、4μg／mL的抗原包被液，完成ELISA板的包被。對各種稀釋度的ASFV陽性標(biāo)準(zhǔn)血清和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清，以及豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒（2型）病和豬細(xì)小病毒病等豬陽性血清進(jìn)行ASFV血清抗體的iELISA檢測，讀取OD450nm值。

圖4 Sf9細(xì)胞中VP73重組蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE of recombinant protein VP73 expressed in Sf9cells

圖5 Sf9細(xì)胞中VP73重組蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.5 Western blot results of recombinant protein VP73 expressed in Sf9cells

以P／N≥2.1，且OD450nm≥0.4時的最大稀釋度為最佳抗原包被液濃度和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清最佳稀釋度。經(jīng)檢測，確定最佳抗原包被液濃度為32μg／mL，ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清最佳稀釋度為1∶200。陰性結(jié)果的平均OD450nm值為0.421，ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清結(jié)果的平均OD450nm值為1.742，相差1.32以上。在對豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒（2型）病和豬細(xì)小病毒病等豬陽性血清的檢測中未發(fā)現(xiàn)有交叉反應(yīng)，初步建立了基于ASFV真核表達(dá)重組蛋白VP73的iELISA檢測方法。

3 討論

ASFV含有約150種蛋白，目前國內(nèi)外研究較多的 ASFV 蛋白主要有 VP73、VP72、P54、I14L、j5R等［1，7］。VP73蛋白是 ASFV 的主要抗原性結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，在感染初期就能檢測到，且產(chǎn)量和抗原性都極為穩(wěn)定，可作為ASFV血清學(xué)診斷的主要材料［1］。國外多個檢測ASFV的ELISA商業(yè)試劑盒均基于VP73蛋白研制，表明VP73蛋白具備良好的特異性、抗原性和穩(wěn)定性，這也是本研究選定非洲豬瘟VP73蛋白作為研究對象并研制基于VP73蛋白的iELISA試劑盒的主要原因。

當(dāng)前，我國對于ASFV VP73蛋白的重組表達(dá)多見于原核表達(dá)［8-9］，而進(jìn)行真核表達(dá)的鮮有報道，可能是因為真核表達(dá)比原核表達(dá)獲得的重組蛋白的表達(dá)量一般較低的緣故，對下游蛋白利用可能帶來一些影響［10］。本研究利用pFastBac HTA昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)了非洲豬瘟VP73蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測和軟件分析統(tǒng)計，VP73重組蛋白主要以可溶形式（超過80%）存在于細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞裂解離心沉淀的細(xì)胞碎片中也能檢測到少量的VP73重組蛋白（少于15%）。VP73重組蛋白可溶部分約占Sf9昆蟲細(xì)胞蛋白總量的35%～40%，實現(xiàn)了較高量的重組蛋白表達(dá)，有利于蛋白的純化（另文發(fā)表）。

本研究選擇對ASFV的VP73蛋白進(jìn)行真核表達(dá)，還基于真核表達(dá)系統(tǒng)在蛋白翻譯后修飾方面較原核表達(dá)系統(tǒng)存在的優(yōu)勢，即具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工，如二硫鍵的形成、糖基化、磷酸化和正確折疊等［10］，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，生物活性高，使用時對脊椎動物安全，適用于蛋白下游工程的推廣應(yīng)用。經(jīng)InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白膠染色和Western blot檢測，顯示表達(dá)的VP73重組蛋白與六組氨酸抗體、ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均能特異性結(jié)合，表明獲得的重組蛋白VP73帶有六組氨酸標(biāo)簽，也具備了良好的特異性和反應(yīng)原性。以重組蛋白VP73為包被抗原建立的基于VP73重組蛋白的ASFV血清抗體iELISA方法，特異性和穩(wěn)定性良好。下一步計劃利用VP73真核表達(dá)重組蛋白制備特異性多抗或單抗，研制檢測ASFV的競爭ELISA檢測方法和試劑，有望打破我國長期以來依賴進(jìn)口ASFV商業(yè)ELISA檢測試劑盒的局面，開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的ASFV檢測技術(shù)和試劑，進(jìn)一步做好我國防控ASFV傳入的技術(shù)儲備。

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