應(yīng)玲云，伍時(shí)華，趙東玲，何啟剛，劉光鵬，黃翠姬，易弋

(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州，545006)

糯米酒是中國(guó)特色的傳統(tǒng)釀造酒，在其釀造過程中酒曲起關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)酒曲的微生物數(shù)量及種類難以控制，造成酒曲質(zhì)量不穩(wěn)定。為穩(wěn)定酒曲質(zhì)量，人們從酒曲中篩選真菌進(jìn)行純菌種制曲。酵母菌的主要作用是將還原糖分解為酒精、CO2和一些副產(chǎn)物(如高級(jí)醇、酯)［1］，其中一些酵母菌(如扣囊復(fù)膜酵母)不僅能產(chǎn)生酒精，還能分泌胞外淀粉酶同化淀粉［2-3］?？勰覐?fù)膜酵母可以在各種淀粉基質(zhì)中存活，在以大米為原料的釀造酒生產(chǎn)過程中起著重要作用［4］。Djien 將扣囊復(fù)膜酵母與魯氏淀粉霉(Amylomyces rouxii)制成純菌種固態(tài)曲，制造出高質(zhì)量的印尼發(fā)酵食品(tapé ketan)［5］。

本文從燒酒曲中篩選出1 株能在YPS 瓊脂平板上生長(zhǎng)的產(chǎn)淀粉酶酵母菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征和18S rDNA、ITS 序列分析鑒定，并對(duì)此酵母的淀粉酶活力及酒精發(fā)酵能力進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

廣西融水燒酒曲;EX Taq DNA 聚合酶;E. Z. N. A.TMGel Extraction Kit;E. Z. N. A.TMPlasmid Mini Kit I;實(shí)驗(yàn)菌株:YW12(本研究)，Saccharomyces cerevisiae GGFS16(本實(shí)驗(yàn)室保藏)。

1.2 培養(yǎng)基

YPD 培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏10，細(xì)菌學(xué)蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂20，pH 自然。

YPS 培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏10，細(xì)菌學(xué)蛋白胨20，可溶性淀粉20，瓊脂20，pH 自然。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏1，醋酸鉀10，葡萄糖0.5，pH 自然。

以上培養(yǎng)基不加瓊脂時(shí)作液體培養(yǎng)基使用，均在115 ℃下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 菌株的篩選

稱取經(jīng)研缽研碎的燒酒曲1.0 g，加入到99 mL 帶玻璃珠的生理鹽水(0.85% NaCl，w/v)中，120 r/min 振蕩10 min。對(duì)菌懸液進(jìn)行10 倍系列稀釋，各取10 μL 涂布于YPS 平板，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d。挑取菌落直徑最大的菌株(YW12)進(jìn)行3 次劃線分離，4 ℃保藏備用。

1.4 YW12 的形態(tài)學(xué)鑒定

1.4.1 菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察

將YW12 接種到Y(jié)PD 瓊脂平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察其菌落形態(tài);將YW12 接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 培養(yǎng)，在0、12、24、36 h 時(shí)取樣，用Motic 數(shù)碼顯微鏡(DMB5)觀察并拍照。

1.4.2 子囊孢子觀察

菌株的子囊孢子觀察方法見文獻(xiàn)［6］。

1.4.3 假菌絲形態(tài)觀察

菌株的假菌絲形態(tài)觀察方法見文獻(xiàn)［7］。

1.5 YW12 的生理生化特征鑒定

菌株的生理生化特征鑒定方法見文獻(xiàn)［8］。

1.6 YW12 的分子鑒定

18S rDNA 序列的PCR 擴(kuò)增采用真菌通用引物，EF4(5’-GGAAGGGGTGTATTTATTAG-3’)，EF3(5’-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’)［9］，擴(kuò)增條件為:94 ℃60 s，55 ℃60 s，72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)。ITS 區(qū)序列的PCR 擴(kuò)增采用真菌通用引物，ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS4(5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)［10］，擴(kuò)增條件為:94 ℃60 s，53℃60 s，72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收、TA 克隆、測(cè)序(上海英俊生物技術(shù)有限公司)。將序列結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTN 分析，并通過MEGA 5.0 軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 YW12 的淀粉酶活力測(cè)定

YW12 的淀粉酶粗酶液制備方法見文獻(xiàn)［11］，利用Yoo 改良法［12］測(cè)其粗酶液的淀粉酶活力。淀粉酶活力單位定義為:加入1 mL 酶液在40 ℃、pH 7.0 條件下，5 min 水解1 mg 可溶性淀粉所需的酶量，即為1 個(gè)酶活力單位，以U/mL 表示［12］。

1.8 YW12 的酒精發(fā)酵能力測(cè)定

糯米糖化液的制備方法見文獻(xiàn)［13］，取100 mL 糯米糖化液裝于500 mL 三角瓶，115 ℃滅菌10 min，備用。取1 mL YW12 菌液(OD600=1.6)接種于100 mL糯米糖化液(含175 g/L 葡萄糖)和100 mL YPD 液體培養(yǎng)基(含100 g/L 葡萄糖)，28 ℃、120 r/min 分別培養(yǎng)3 d 和4 d，用蒸餾法［14］測(cè)其酒精度。

在YW12 的生理生化特征鑒定、淀粉酶活力和酒精發(fā)酵能力測(cè)定中，S.cerevisiae GGFS16 作為參考菌株。

2 結(jié)果與討論

2.1 YW12 的形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)

YW12 在YPD 平板上28 ℃培養(yǎng)3 d，其菌落呈圓形、白色，同心圓明顯，干燥不透明，表面及邊緣呈菌絲狀，直徑5 ～8 mm(圖1a)。

2.1.2 細(xì)胞形態(tài)

YW12 在YPD 液體培養(yǎng)基中28 ℃、120 r/min 培養(yǎng)，在0 h、12 h、24 h、36 h 時(shí)，其細(xì)胞形態(tài)如圖1b -1e。YW12 剛接入YPD 液體培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞大多是橢圓形單細(xì)胞(圖1b);培養(yǎng)12 h 時(shí)，細(xì)胞多數(shù)呈菌絲狀(圖1c);培養(yǎng)24 h 時(shí)，有菌絲但主要是單細(xì)胞(圖1d);培養(yǎng)36 h 時(shí)，細(xì)胞大多是單細(xì)胞(圖1e)。YW12 在YPD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h 的過程中，其細(xì)胞形態(tài)呈動(dòng)態(tài)變化。

2.1.3 子囊孢子形態(tài)

YW12 在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上25 ℃、120 r/min 培養(yǎng)5 d，其子囊呈卵圓形，含有2 個(gè)帽形子囊孢子(圖1f 和圖1g)。

2.1.4 假菌絲形態(tài)

YW12 在YPD 培養(yǎng)基載片培養(yǎng)3 d，其菌絲沒有橫隔，各細(xì)胞間僅以狹小的面積相連，在分隔處縊縮，呈藕節(jié)狀(圖1h)，此菌絲為假菌絲。

由YW12 的菌落、細(xì)胞、子囊孢子和假菌絲形態(tài)鑒定推測(cè)YW12 可能是扣囊復(fù)膜酵母。

圖1 YW12 的菌落和細(xì)胞形態(tài)特征Fig.1 The colony and cell morphological characteristics of YW12

2.2 YW12 的生理生化特征鑒定

在糖發(fā)酵測(cè)試中，YW12 能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，但不能利用乳糖(表1);在同化反應(yīng)及其它特征測(cè)試中，YW12 能同化葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉和肌醇，在37 ℃下能生長(zhǎng)，在YPD 瓊脂培養(yǎng)基(含60%葡萄糖)上不能生長(zhǎng)(表2)。將YW12 與S. fibuligera 的生理生化特征［15］相比較，初步確認(rèn)YW12 為扣囊復(fù)膜酵母。

表1 菌株YW12 和S.cerevisiaeGGFS16 的糖發(fā)酵性能Table 1 The fermentation of different sugars in YW12 and S.cerevisiae GGSF16

表2 菌株YW12 和S.cerevisiae GGFS16 的同化反應(yīng)及其它特征Table 2 Assimilation reactions and other characteristics of YW12 and S.cerevisiae GGSF16

2.3 YW12 的18S rDNA 序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

酵母菌18S rRNA 存在不同保守程度序列的鑲嵌現(xiàn)象(從高保守區(qū)到半保守區(qū)到高可變區(qū))，使得18S rDNA 可以用來衡量較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，作為鑒定到屬的指標(biāo)［16］。

為進(jìn)一步確定YW12 的分類地位，通過對(duì)其18S rDNA 序列的BLASTN 分析，并調(diào)取其相關(guān)菌株的18S rDNA 序列，利用MAGE 5.0 軟件的鄰位連接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析(圖2)。結(jié)果表明，YW12 屬于復(fù)膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)，與Saccharomycopsis fibuligera NRRL Y-2388T聚在一個(gè)分支中，相似性為99%。

圖2 YW12 與相關(guān)菌株的18S rDNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 18S rDNA sequence in YW12 and its closest relatives

2.4 YW12 的ITS 區(qū)序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

ITS 區(qū)介于l8S rDNA 和28S rDNA 之間，并被5.8S rDNA 分為ITS1 和ITS2 兩個(gè)區(qū)。ITS1 和ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯，這一特點(diǎn)使ITS 區(qū)適合于屬內(nèi)種的區(qū)分［17］。若兩個(gè)菌株整個(gè)ITS 區(qū)序列相似性大于等于99%，則可認(rèn)為是同一種［18］。

通過對(duì)YW12 的ITS 序列的BLASTN 分析，并調(diào)取其相關(guān)菌株的ITS 序列，利用MAGE 5.0 軟件的鄰位連接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析(圖3)。結(jié)果表明，YW12 與Saccharomycopsis fibuligera NN2501聚在一個(gè)分支中，相似性為99%。結(jié)合YW12 的18S rDNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的結(jié)果，可以進(jìn)一步確認(rèn)YW12 是扣囊復(fù)膜酵母。

2.5 YW12 的淀粉酶活力測(cè)定

將YW12 接種于YPS 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 培養(yǎng)4 d，用Yoo 改良法測(cè)其粗酶液的淀粉酶活力，S. cerevisiae GGFS16 為參考菌株。結(jié)果表明，YW12 粗酶液的淀粉酶活力為 49.8 U/mL，S. cerevisiae GGFS16 粗酶液的淀粉酶活力為0 U/mL。YW12 能分泌胞外淀粉酶，S. cerevisiae GGFS16 不能分泌胞外淀粉酶，和Naoko 等［11］實(shí)驗(yàn)得出扣囊復(fù)膜酵母能分泌胞外淀粉酶，但釀酒酵母不能分泌胞外淀粉酶的結(jié)論一致。

圖3 YW12 與相關(guān)菌株的ITS 區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the ITS region sequence in YW12 and its closest relatives

2.6 YW12 的酒精發(fā)酵能力測(cè)定

酵母菌能把還原糖轉(zhuǎn)化為酒精和CO2，通過測(cè)定最終酒精度判定其發(fā)酵能力。本研究將YW12 接種于糯米糖化液(含175 g/L 葡萄糖)和YPD 液體培養(yǎng)基(含100 g/L 葡萄糖)，28 ℃分別發(fā)酵3 d 和4 d，其酒精度(v/v)為5.63% 和1.71%。將S. cerevisiae GGFS16 接種于糯米糖化液(含175 g/L 葡萄糖)和YPD 液體培養(yǎng)基(含100 g/L 葡萄糖)，28 ℃分別發(fā)酵3 d 和4 d，其酒精度(v/v)為10.33%和4.45%。YW12 在糯米糖化液和YPD 液體培養(yǎng)基中發(fā)酵酒精能力比S. cerevisiae GGFS16 低。YW12 的發(fā)酵酒精度不高，可能與初葡萄糖濃度偏高有關(guān)。發(fā)酵液的葡萄糖濃度影響酵母菌生長(zhǎng)，低濃度葡萄糖使酵母菌因營(yíng)養(yǎng)不足而生長(zhǎng)緩慢，高濃度葡萄糖抑制其酒精發(fā)酵［19］。

圖4 菌株YW12 和GGFS16 發(fā)酵酒精度的比較Fig.4 Ethanol fermentation of YW12 and GGFS16

3 結(jié)論

本文從燒酒曲中分離出1 株產(chǎn)淀粉酶酵母菌(YW12)，通過形態(tài)、生理生化特征及18S rDNA、ITS區(qū)序列分析鑒定，確定其為扣囊復(fù)膜酵母。YW12 在YPS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，其粗酶液的淀粉酶活力為49.8 U/mL。YW12 在糯米糖化液(含175 g/L 葡萄糖)中發(fā)酵3 d 的酒精度為5.63%(v/v)。YW12既能同化淀粉又能發(fā)酵產(chǎn)生酒精，具有用于純菌種釀造糯米酒的潛能，為進(jìn)一步開展純菌種釀造糯米酒奠定基礎(chǔ)。

［1］ Rojas V，Gil J V，Pi?aga F，et al. Studies on acetate ester production by non-Saccharomyces wine yeasts［J］. International Journal of Food Microbiology，2001，70(3):283 -289.

［2］ Limtong S，Sintara S，Suwanarit P，et al. Yeast diversity in Thai traditional fermentation starter (Loog-pang)［J］.Kasetsart J (Nat Sci)，2002，36:149 -158.

［3］ Hesseltine C W，Kurtzman C P. Yeasts in amylolytic food starters［J］. Anales del Instituto de Biologia，1990(1):1-7.

［4］ Nga B H，Chiu L L，Koh S I，et al. Occurrence of genetic segregation in a putative haploid strain of Endomyces fibuliger met by spontaneous sectoring of protoplast fusants［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology，1994，10(4):465 -471.

［5］ Djien K S. Tape fermentation［J］. Applied Microbiology，1972，23(5):976 -978.

［6］ Adams A，Gottschling D E，Kaiser C A，et al. Methods in yeast genetics:A cold spring harbor laboratory course manual，1997 Edition［M］. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1998:98.

［7］ 路福平，杜連祥. 工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］. 中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005:17.

［8］ 王曉紅. 產(chǎn)淀粉酶海洋酵母菌的篩選、鑒定及粗酶性質(zhì)的研究［D］. 中國(guó)海洋大學(xué)，2007:23 -25.

［9］ Anderson I C，Campbell C D，Prosser J I. Potential bias of fungal 18S rDNA and internal transcribed spacer polymerase chain reaction primers for estimating fungal biodiversity in soil［J］. Environmental Microbiology，2003，5(1):36-47.

［10］ Jeyaram K，Singh W M，Capece A，et al. Molecular identification of yeast species associated with‘Hamei’—A traditional starter used for rice wine production in Manipur，India［J］. International journal of food microbiology，2008，124(2):115 -125.

［11］ Tsuyoshi N，F(xiàn)udou R，Yamanaka S，et al. Identification of yeast strains isolated from marcha in Sikkim，a microbial starter for amylolytic fermentation［J］. International journal of food microbiology，2005，99(2):135 -146.

［12］ Su S，Zhang L，Guo L. Screening high efficiency degradation starch and protein strains from potato skins slurry［J］. Modern Applied Science，2011，5(2):235.

［13］ Dung N，Rombouts F M，Nout M. Functionality of selected strains of moulds and yeasts from Vietnamese rice wine starters［J］. Food microbiology，2006，23(4):331 -340.

［14］ 傅金泉. 黃酒生產(chǎn)技術(shù)［M］. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:436.

［15］ Barnett J A，Payne R W，Yarrow D. 酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)［M］. 青島:青島海洋大學(xué)出版社，1991:116 -119.

［16］ 許超德，李紹蘭. 核酸分子系統(tǒng)學(xué)方法在酵母菌分類中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2004，31(3):126-129.

［17］ Mitchell T G，White T J，Taylor J W. Comparison of 5.8 S ribosomal DNA sequences among the basidiomycetous yeast genera Cystofilobasidium，F(xiàn)ilobasidium and Filobasidiella［J］. Medical Mycology，1992，30(3):207 -218.

［18］ Landeweert R，Leeflang P，Kuyper TW，et al. Molecular identification of Ectomycorrhizal Mycelium in soil horizons［J］. Applied and Environmental Microbiology，2003，69(1):327 -333.

［19］ Pereira F B，Guimar?es PMR，Teixeira J A，et al. Selection of Saccharomyces cerevisiae strains for efficient very high gravity bio-ethanol fermentation processes［J］. Biotechnology Letters，2010，32(11):1 655 -1 661.