黃加保，唐蕾，華子安，毛忠貴

1(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2 (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，Apx，EC1. 11. 1.11)，也稱維生素C 過氧化物酶，是一種以抗壞血酸(Ascorbic acid，AsA)為電子供體的過氧化物酶。1976 年Foyer 和Halliwell［1］在菠菜葉中發(fā)現(xiàn)了一種脫氫抗壞血酸還原酶，1981 年Nakano和Asada［2］將其正式定名為Apx。Apx 主要存在于高等植物、真核藻類及某些藍(lán)細(xì)菌中。在高等植物中，已報道4 種不同細(xì)胞定位的Apx 同工酶，它們分別為:葉綠體基質(zhì)Apx(sApx)、類囊體膜Apx(tApx)、微體Apx(mbApx)和胞質(zhì)Apx(cApx)［3］。Apx 在植物中有特定的生理功能，是清除植物體內(nèi)H2O2的關(guān)鍵酶之一，同時在植物抗逆性、果蔬采后品質(zhì)變化等方面也發(fā)揮著重要作用。

芥藍(lán)(Brassica alboglabra L. )是十字花科蕓薹屬草本植物，屬甘藍(lán)的一個變種［4］，原產(chǎn)于中國南部，是我國著名的特產(chǎn)蔬菜之一，主要以花薹為產(chǎn)品，在廣東、福建等省栽培。芥藍(lán)具有很高的營養(yǎng)價值，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)和芥子油苷等，特別是維生素C 含量很高［5-7］。維生素C 是Apx 的底物，其含量的高低與Apx 的活性密切相關(guān)。人們已研究了茶葉［8］、擬南芥［9］、大豆［10］、鹽地堿蓬［11］等植物的Apx，但與芥藍(lán)Apx 相關(guān)的研究尚未見報道。直接從芥藍(lán)中分離純化Apx，工序復(fù)雜，耗時耗力，且不易實現(xiàn)大規(guī)模制備。本研究旨在通過基因工程方法從芥藍(lán)幼苗葉中擴(kuò)增apx 基因，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)。重組蛋白經(jīng)簡單的Ni2+柱純化就能大量制備，為進(jìn)一步研究Apx 的生理特性和功能打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

宿主菌E. coil BL21 由本實驗室保藏，表達(dá)質(zhì)粒pET-28a 購于Novagen 公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體瓊脂培養(yǎng)基:2%瓊脂，自來水。

LB 液體培養(yǎng)基:酵母提取物5 g /L，胰蛋白胨10 g /L，NaCl 10 g /L，pH 7.0 ～7.4。

LB 固體培養(yǎng)基:LB 液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 的合成

芥藍(lán)無菌苗的種植 選取籽粒飽滿的芥藍(lán)種子(北京南無科貿(mào)有限責(zé)任公司)先用70%的乙醇浸泡1 min 后無菌水沖洗3 次，再用10% 雙氧水浸泡5 min，無菌水沖洗5 次。無菌環(huán)境下將種子接到滅菌的固體瓊脂培養(yǎng)基中，26℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 周，光照時間為8 h/d。

總RNA 的提取 采用改進(jìn)的CTAB-LiCl 沉淀法［12］，從生長1 周的幼苗葉中提取總RNA，利用Reverse Transcriptase M-MLV(大連寶生物工程有限公司)合成cDNA 鏈。以cDNA 為模板進(jìn)行RT -PCR及RACE 擴(kuò)增。

1.2.2 apx 基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 公布的蕓薹屬植物過氧化物酶基因序列，以保守序列為參照(引物見表1 apx fra)，得到apx 部分基因，之后按照5’-Full RACE Kit 和3’-Full RACE Core Set Ver.2.0(大連寶生物工程有限公司)中的操作說明，分別進(jìn)行5’-RACE 和3’-RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增引物見表1。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，用DNAMAN V6 軟件進(jìn)行序列拼接，最后得到apx 基因全序列。根據(jù)基因全序列設(shè)計帶有限制性酶切位點的引物(見表1 apx ful)，進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增、純化、構(gòu)建質(zhì)粒。

表1 apx 基因擴(kuò)增引物序列Table 1 Sequences of primers for apx gene amplification

1.2.3 pET-28a-apx 的構(gòu)建及克隆

將RT-PCR 的純化產(chǎn)物及載體pET-28a 經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28aapx。將pET-28a-apx 轉(zhuǎn)化E. coil BL21 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 μg/mL 卡那霉素(kanamycin，kan)的LB 平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于含kan (100 μg/mL)的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用MiniBEST Plasmid Purification Kit(大連寶生物工程有限公司)提取質(zhì)粒，雙酶切驗證。將篩選的陽性重組菌置于甘油管中-20℃保存。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)鑒定及條件優(yōu)化

重組蛋白表達(dá)鑒定 將陽性重組菌于37℃，200 r/min 培養(yǎng)過夜，以2%的接種量轉(zhuǎn)接至含有kan 的新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)2.5 h 左右，至OD600達(dá)到0.6，向培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃，200 r/min，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收獲菌體。用20 mmol/L (pH7.5)的Tris-HCl 緩沖液(含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%脫氧膽酸鈉)懸浮菌體，濕菌體與緩沖液的比例為1∶16 (W/V)。200 w，工作1 s，間歇3 s，超聲破碎15 min。10 000 r/min 離心25 min 得到上清液，測定酶活性并進(jìn)行SDS-PAGE 電泳鑒定。

表達(dá)條件優(yōu)化 采用單因素實驗，誘導(dǎo)條件:溫度為16、23、30 和37℃，IPTG 的終濃度為0.05、0.1、0.2和0.3 mmol/L (不加IPTG 為對照);誘導(dǎo)時間為0、4、8 、10 和12 h，收獲菌體，懸浮，破碎離心，測定上清液酶活力和蛋白濃度，計算比酶活。

1.2.5 酶活力及蛋白濃度的測定

參照沈文飚［13］的方法并加以改進(jìn)。200 μL 的反應(yīng)體系:依次加入終濃度為0.5 mmol/L 乙二胺四乙酸，0.5 mmol/L AsA，50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)和適量酶液，最后加入終濃度為0.2 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，室溫下測定290 nm 處的吸光值，記錄反應(yīng)30 s 內(nèi)吸光值的變化(△OD)。以1min 氧化1 μmol AsA 的酶量作為1 個酶活性單位(U)。比酶活= U/蛋白質(zhì)濃度(U/g)。

蛋白質(zhì)濃度測定采用BCA 試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.6 重組蛋白純化及最適酶反應(yīng)條件測定

重組蛋白純化采用Akata avant 純化系統(tǒng)。將23℃，0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h 的菌液離心沉淀，以結(jié)合緩沖液(20 mmol/L 磷酸緩沖液，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH7.4)重懸菌體，濕菌體與緩沖液的比例為1∶16 (W/V)。超聲破碎后離心收集上清液，上樣至預(yù)先平衡的Histrap FF crude柱(GE Healthcare，Life Science)，按照說明書操作方法，純化重組Apx，純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定及酶活性測定。

酶的最適反應(yīng)條件測定將純化后的酶蛋白在不同溫度(20、25、30、35、40、45℃)和不同的pH (3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9)下測定酶活，將最高酶活計為100%，計算相對酶活。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 芥藍(lán)Apx 編碼基因的獲得

根據(jù)GenBank 公布的蕓薹屬植物過氧化物酶的基因序列，以保守序列為參照，設(shè)計引物apx fra，以芥藍(lán)cDNA 為模板RT-PCR 得到400 bp 左右條帶(圖1A)，將該條帶割膠純化測序，依照測序結(jié)果設(shè)計apx 3’和5’RACE 引物，分別得到700 bp (圖1C)和550 bp (圖1B)左右的3’及5’RACE 產(chǎn)物，將產(chǎn)物測序后用DNAMAN V6 軟件拼接，得到apx 基因序列全長(GenBank 登錄號:KC894750)。

圖1 PCR 擴(kuò)增apx 基因片段電泳圖Fig.1 Electrophoresis diagram of apx amplification fragments by PCR

采用DNAMAN V6 軟件分析得到芥藍(lán)apx 編碼區(qū)全長為753 bp，ATG 是起始密碼，TAA 為終止密碼，共250 氨基酸，分子質(zhì)量推算約為27.6 kDa。將apx 在NCBI 中BLAST 比對，該基因與蕓薹屬甘藍(lán)apx 的序列相似度高達(dá)99%。初步鑒定該apx 屬于芥藍(lán)抗壞血酸過氧化物酶的胞質(zhì)同工酶基因。

2.2 pET-28a-apx 在E. coil BL21 克隆表達(dá)

將apx 編碼基因插入表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-apx 轉(zhuǎn)化至E. coil BL21 中，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，酶切、瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果表明:重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I 和Not I 雙酶切、電泳后，在6 000 bp 和750 bp 各出現(xiàn)了一條帶，分別為質(zhì)粒和目的基因，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 pET-28a-apx 雙酶切鑒定電泳圖Fig.2 Electrophoresis diagram of pET-28a-apx digested by two restriction enzymes

分別收集含有pET-28a 及pET-28a-apx 質(zhì)粒的E. coil BL21 細(xì)胞，并將細(xì)胞破碎，離心得到上清液，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明，在含有pET-28a-apx 質(zhì)粒，并經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液中，有明顯的目的蛋白條帶，分子質(zhì)量為29 kDa (圖3)。

圖3 Apx 表達(dá)及純化的SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE showing Apx expression and purification

2.3 重組蛋白pET-28a-apx 表達(dá)條件優(yōu)化

為了提高重組蛋白的酶活性，本文對影響酶表達(dá)水平的關(guān)鍵因子即誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和溫度進(jìn)行了研究。結(jié)果表明當(dāng)IPTG 濃度為0.2 mmol/L 時，Apx 比酶活最大，相比對照提高了25%，當(dāng)IPTG 的濃度小于0.2 mmol/L，比酶活隨濃度的升高有一定程度的提高，當(dāng)IPTG 的濃度繼續(xù)升高時，比酶活下降(圖4 A)。當(dāng)IPTG 誘導(dǎo)時間為10 h 時，比酶活達(dá)到最大，小于10 h 時，隨誘導(dǎo)時間的加長，比酶活有顯著的提高，當(dāng)誘導(dǎo)時間大于10 h 時，比酶活較10 h下降了28% (圖4 B)。分析原因可能是在誘導(dǎo)前期，菌體的活力及蛋白表達(dá)量逐漸升高，蛋白降解率低，酶活升高;隨誘導(dǎo)時間的延長(＞10 h)，菌體活力明顯下降，蛋白表達(dá)量降低，蛋白降解率升高，酶活降低。

溫度對重組蛋白的表達(dá)有顯著影響，有研究報道表明，在較低溫度(23℃)下，菌體的比生長速率較低，但菌體不易自溶，菌體活力及質(zhì)粒穩(wěn)定性升高，代謝副產(chǎn)物的生成減少，蛋白表達(dá)更多。并且低溫降低了熱激蛋白及蛋白酶的合成，也降低了重組蛋白的合成速率，使之與蛋白的折疊速率更相近，更多的形成可溶的有活性的蛋白。溫度太低(16℃)，菌體的生長明顯受抑制，蛋白表達(dá)不足，酶活降低［14］。本文中誘導(dǎo)溫度為23℃(圖4 C)，Apx 比酶活達(dá)到最高，溫度太低(16℃)或太高(37℃)，都會影響重組蛋白的表達(dá)。

圖4 表達(dá)條件對重組蛋白Apx 酶活性的影響Fig.4 Effect of expression conditions on recombinant Apx activity

2.4 重組蛋白純化及酶最適反應(yīng)條件

將重組蛋白經(jīng)Ni2+柱純化，去除雜蛋白(圖3)，并進(jìn)行酶的最適pH 和溫度測定。結(jié)果表明:該酶的最適pH 值為6.5，當(dāng)pH 在4 ～7.5 時，酶活均為最高酶活的80%以上(圖5)。最適溫度為40℃，而當(dāng)溫度在30 ～40℃時，酶活均較高，在最高酶活的90%以上，且變化不顯著(圖6)。

圖5 pH 對Apx 酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on Apx activity

圖6 溫度對Apx 酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on Apx activity

3 結(jié)論

研究葉菜類植物Apx 的性質(zhì)，對于控制采后蔬菜品質(zhì)的變化具有十分重要的意義。與直接從芥藍(lán)中提取Apx 相比，芥藍(lán)apx 基因在工程菌中表達(dá)，具有培養(yǎng)周期短、成本低、表達(dá)過程易于控制等諸多優(yōu)點，且apx 基因受啟動子基因調(diào)控，通過外源物添加及誘導(dǎo)條件優(yōu)化等方法可誘導(dǎo)apx 高效表達(dá)。此外，在apx 基因兩端添加His 標(biāo)簽，容易分離純化Apx，為更好地研究其酶學(xué)性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性等奠定了基礎(chǔ)。本研究主要得到了以下結(jié)論:

首先，通過RNA 提取，RT-PCR，RACE 等從芥藍(lán)幼苗中擴(kuò)增出了apx 基因全序列，在NCBI 庫中比對，初步證實為胞質(zhì)apx。與甘藍(lán)apx 相似度高達(dá)99%。其次，用雙酶切的方法構(gòu)建了pET-28a-apx，并在E.coil BL21 中成功表達(dá)。通過誘導(dǎo)條件的單因素優(yōu)化，得到apx 誘導(dǎo)表達(dá)的最適條件為:添加0.2 mmol/L IPTG，23℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h。最后，用AKata avant 純化系統(tǒng)及鎳柱純化出電泳純Apx，得出pH6.5 和40℃是該酶的最適反應(yīng)條件。

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