李攀 顧振鵬 劉順振＊ 劉晶晶 代培培 劉志慧

（1．濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科二病區(qū)，＊口腔科，山東濱州 256603；2．濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院婦產科，山東煙臺 264100）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）的發(fā)生、發(fā)展與雌激素的暴露密切相關，是雌激素依賴性疾?。?］。芳香化酶（cytochrome P450 19，CYP19）和兒茶酚氧位甲基轉移酶（catechol－O－methyltransferase，COMT）是雌激素合成和代謝過程中的關鍵酶。因此，CYP19、COMT基因多態(tài)性可能與EMs發(fā)病有關。本研究采用高分辨率溶解曲線（high resolution melting，HRM）分析技術，佐以聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）分析技術，研究CYP19基因240A／G、COMT基因1947G／A位點單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與山東省濱州地區(qū)漢族婦女EMs的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2011年9月—2012年5月在濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產科行手術治療并經術后病理證實的EMs患者80例（包括卵巢巧克力囊腫30例、子宮腺肌癥50例）為EMs組；選擇同期行婦科手術并經術后病理排除EMs的患者40例為對照組。兩組患者者均為漢族，且年齡、體質量、妊娠次數比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）?；颊呔炇鹬橥鈺山M患者術后第3天取清晨空腹肘靜脈血3mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，保存于－80℃冰箱。

1．2 方法

1．2．1 全血DNA的提取及檢測 采用酚－氯仿提取法提取全血DNA，并用1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，紫外線分光光度儀測定DNA純度均大于1．7。

1．2．2 PCR 擴增引物的設計 參考相關文獻［2－3］設計PCR引物，序列如下：（1）CYP19基因240A／G的 上 游 引 物 5＇－AGTAACACAGAACAGTTGCA－3＇，下游引物5＇－TCCAGACTCGCATGAATTCTCCGTA－3＇；（2）COMT 基因1947G／A 的上游引物5＇－T CGTGGACGCCGTGATTCAGG－3＇，下 游 引 物 5＇－AGGTCTGACAACGGGTCAGGC－3＇。以上引物均由上海生物工程有限公司合成。

1．2．3 PCR擴增條件 （1）CYP19基因240A／G位點PCR反應條件：95℃2min；95℃30s、51℃30s、72℃30s，共32個循環(huán)；最后72℃10min。（2）COMT基因1947G／A 位點PCR反應條件：95℃2min；95℃30s、59℃30s、72℃30s，共32個循環(huán)；72℃10min，4℃保存。兩者PCR產物均采用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．2．4 采用HRM技術對基因多態(tài)性分型 （1）將9μL PCR產物與1μL LC Green于暗室中依次加入96孔PCR反應板并混勻，用1滴礦物油封液面；（2）95℃30s，25℃30s，1個循環(huán)，保存于4℃；（3）將96孔板4000r／min離心30s，放入 Lightscanner儀器中，采用軟件分析溶解曲線，得出基因型，并與酶切結果相互佐證。CYP19 240A／G、COMT 1947G／A各基因型見圖1～2。

1．2．5 限制性內切酶酶切 （1）CYP19 240A／G酶切反應體系：PCR產物3μL，10×T buffer 2μL，0．1%BSA 2μL，限制性核酸內切酶RsaⅠ1μL（10 U／μL），滅菌雙蒸水12μL，共20μL，37℃水浴1 h；（2）COMT 1947G／A酶切反應體系：PCR產物5 μL，10×G buffer 2μL，內切酶 N1aⅢ0．5μL（5 U／μL），滅菌雙蒸水12．5μL，共20μL，37℃水浴16h。以上兩組酶切產物均用3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察酶切條帶，判斷基因型。

圖1 CYP19 240A／G各基因型溶解曲線

圖2 COMT 1947G／AG各基因型溶解曲線

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0軟件進行統(tǒng)計學分析。對兩組樣本的CYP19和COMT基因頻率進行Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗。對兩組樣本人群CYP19和COMT基因型及各等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗，計算比值比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），以分析CYP19和COMT突變基因型及突變基因型與EMs發(fā)病風險關系。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 采用HRM分析儀得到的基因型統(tǒng)計 （1）CYP19 240A／G：EMs組 AA 17例，AG 41例，GG 22例；對照組 AA 22例，AG 13例，GG 5例；（2）COMT 1947G／A：EMs組GG 46例，GA 28例，AA 6例；對照組GG 24例，GA 12例，AA 4例。以上結果與酶切結果基本一致。對兩基因在EMs組和對照組中的基因型頻率進行Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗，結果P均＞0．05，可進行χ2檢驗。

2．2 CYP19 240A／G各基因型及等位基因分布頻率與EMs的關系 EMs組各基因型及等位基因分布頻率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2＝14．096，P＝0．001；χ2＝12．803，P＝0．001），等位基因G突變可使EMs發(fā)病風險增加2．809倍，95%CI為1．580～4．992。EMs組攜帶G等位基因突變的基因型（AG＋GG）與野生型（AA）比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝13．846，P＝0．0001），攜帶 AG 和GG基因型的婦女EMs發(fā)病風險增加了4．529倍，95%CI為1．992～10．300。見表1～3。

2．3 COMT 1947G／A各基因型及等位基因分布頻率與EMs的關系 EMs組各基因型及等位基因分布頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），表明COMT 1947G／A位點等位基因突變與EMs發(fā)病無相關性。EMs組攜帶A等位基因突變的基因型（GA＋AA）分別與野生型（GG）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＝0．793），這表明與野生型（GG）相比，攜帶A等位基因的基因型（GA＋AA）不能增加EMs的發(fā)病風險。見表1～3。

表1 EMs組及對照組CYP19、COMT各基因型分布頻率比較n（%）

表2 EMs組及對照組CYP19、COMT各等位基因分布頻率比較n（%）

表3 EMs組與對照組CYP19、COMT突變型和野生型比較n（%）

3 討 論

自1980年Simpson等首次對EMs進行遺傳學研究，證明該病可能有家族史后，國內外學者開始對引起EMs遺傳學改變的因素進行研究。有研究［4］表明，EMs具有家族聚集性，患者一級親屬發(fā)病風險是無家族史者7倍，單卵雙胎孿生姐妹發(fā)病率高達75%。近幾年的研究［5］結果表明，EMs是一種由多個基因位點與環(huán)境、激素、免疫等因素相互作用所致的疾病。

HRM分析技術是近年來國際上新興的一種檢測SNP、基因突變及基因分型的工具。其原理如下：雙鏈DNA熒光染料與PCR產物結合后，升溫過程中SNP位點因不匹配會使雙鏈DNA解開，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，實時監(jiān)測熒光強度與時間曲線的關系就可以區(qū)分不同SNP位點和不同基因型。HRM分析技術具有操作簡便、特異性高、速度快、對樣品無污染等優(yōu)點。

本研究應用HRM分析技術研究CYP19 240 A／G、COMT 1947G／A位點的SNP與山東省濱州地區(qū)漢族婦女EMs發(fā)病的相關性。結果顯示，EMs組CYP19 240A／G位點各基因型及等位基因分布頻率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），其中等位基因G突變可使EMs發(fā)病風險增加2．809倍。EMs組攜帶G等位基因突變的AG和GG基因型的婦女EMs發(fā)病風險增加4．529倍。EMs組COMT 1947G／A位點各基因型及等位基因分布頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），說明COMT 1947G／A位點多態(tài)性與EMs發(fā)病無相關性。攜帶A等位基因突變的基因型（GA＋AA）并不增加EMs的發(fā)病風險。

采用HRM分析SNP是近年來新興的檢測手段，其特異性高、耗時短，適用于大樣本統(tǒng)計研究。本實驗所研究的基因種類局限，且樣本量較少，在統(tǒng)計中難免出現偏差，僅代表部分濱州漢族婦女的情況。在今后的研究中，應采取多地區(qū)、多種族、大樣本、多基因聯(lián)合的研究，以更好的研究EMs的發(fā)病機制。

［1］ Kitawaki J，Kado N，Ishihara H，et al．Endometriosis：the pathophysiology as an estrogen－dependent disease［J］．J Steroid Biochem Mol Biol，2002，83（1－5）：149－155．

［2］ Miyoshi Y，Iwao K，Ikeda N，et al．Breast cancer risk associated with polymorphism in CYPl9Japanese women［J］．Int J Cancer，2000，89（4）：325－328．

［3］ Kunuqi H，Nanko S，Ueki A，et al．High and low activity alleles of Catechol－O－methyltransferase gene：ethnic difference and possible association with Parkinson’s disease［J］．Neurosci Lett，1997，221（2－3）：202－204．

［4］ 樂杰．婦產科學［M］．第7版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：326－327．

［5］ Bischoff F，Simpson JL．Genetic basis of endometriosis［J］．Ann NY Acad Sci，2004，1034：284－299．