孫海香 楊欣榮 徐泱 樊嘉，2

（1．復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032；2．復(fù)旦大學(xué)附屬生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032）

肝動(dòng)脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）是治療中晚期肝癌常選的非手術(shù)治療方法。缺氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia inducible factor 2 alpha，HIF－2α）是細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境的重要轉(zhuǎn)錄因子，是HIFs家族的重要成員之一。HIF－2α參與細(xì)胞代謝、增殖、凋亡和血管生成，在非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤中表達(dá)異常［1－2］。目前，關(guān)于 HIF－2α在肝癌中的表達(dá)研究較少，且爭(zhēng)議頗多［3－6］。本研究旨在探討 TACE治療對(duì)肝癌組織中HIF－2α表達(dá)水平的影響，并分析其表達(dá)水平與其他病理因素的相關(guān)性，企盼闡明HIF－2α在肝癌的發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1．1 一般資料 采用復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院2001—2005年經(jīng)TACE治療后手術(shù)切除的157例肝癌患者的肝癌組織，用于組織芯片染色。組織芯片的制備參考Gao等［7］的作法。從上述157例肝癌組織中隨機(jī)選取30例肝癌組織；同時(shí)收集未經(jīng)TACE治療而直接行手術(shù)切除的30例肝癌患者的肝癌組織。

1．2 試劑 RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（江蘇碧云天公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒（日本 Takara公司）；HIF－2α及3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程公司合成；HIF－2α及GAPDH抗體（英國Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗免疫組化試劑盒（上海長(zhǎng)島生物技術(shù)公司）。

1．3 RT－PCR檢測(cè) HIF－2α基因表達(dá) 肝癌組織RNA抽提參照Trizol試劑盒說明書操作。HIF－2α和GAPDH的引物序列同參考文獻(xiàn)［4］，按試劑盒說明書操作，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min后；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1．4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè) HIF－2α蛋白表達(dá) 采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）檢測(cè)標(biāo)本組織抽提液中總蛋白的濃度，操作步驟參照說明書。

1．5 免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測(cè) HIF－2α蛋白分布 采用IHC－SP法，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。按照陽性細(xì)胞數(shù)占同類計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比，將染色結(jié)果分為低表達(dá)與高表達(dá)，以50%為標(biāo)準(zhǔn)。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 TACE治療后肝癌組織中 HIF－2α的表達(dá)TACE治療后肝癌組織中HIF－2α的mRNA水平顯著上升（P＜0．05），見圖1A；Western blot也顯示，TACE治療后HIF－2α蛋白表達(dá)水平顯著上升，與非TACE治療而直接手術(shù)治療的肝癌患者的HIF－2α表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見圖1B。

圖1 TACE組和手術(shù)組術(shù)后肝癌組織中HIF－2α的mRNA及蛋白的表達(dá)水平

2．2 IHC分析TACE治療后肝癌組織中 HIF－2α的表達(dá)分布 IHC顯示，HIF－2α蛋白陽性信號(hào)主要定位于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞核和胞漿中，呈棕黃色或者褐色，見圖2。

圖2 肝癌組織中HIF－2α表達(dá)情況（A～C：×100；D～F：×200）

2．3 HIF－2α在TACE治療的肝癌患者中的臨床意義 甲胎蛋白水平、γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平、腫瘤直徑和包膜完整性與肝癌患者的總體生存時(shí)間（overall survival，OS）相關(guān)（P＜0．05）；γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平、腫瘤直徑和包膜完整性與肝癌患者的無瘤生存時(shí) 間 （disease－free survival，DFS）相 關(guān) （P＜0．05）；HIF－2α蛋白表達(dá)水平與肝癌患者的 OS相關(guān)（P＜0．05），而與DFS無關(guān)（P＞0．05）。

3 討 論

TACE是中晚期肝癌常用的治療方法。TACE既可直接在腫瘤組織中施以藥物殺傷癌細(xì)胞，又可栓塞供養(yǎng)腫瘤的血管，阻斷腫瘤血供，致腫瘤組織缺血、缺氧，進(jìn)而使腫瘤失去活力。HIF－2α能調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子－α、c－Myc、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、Twist等多個(gè)在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成等過程中起著重要作用的基因的表達(dá)。目前，關(guān)于HIF－2α在肝癌中的研究相對(duì)較少，其作用也有爭(zhēng)議。有研究［6］指出，HIF－2α表達(dá)水平與肝癌中的血管密度相關(guān)，HIF－2α水平高的患者預(yù)后較差。也有研究［4］表明，HIF－2α可促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬、凋亡，提示HIF－2α可能在肝癌發(fā)生過程中起著抑制作用。也有研究［8］發(fā)現(xiàn)，HIF－2α參與E2F1信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，肝癌組織中HIF－2α的表達(dá)水平與腫瘤直徑呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TACE治療后肝癌組織中HIF－2α的表達(dá)水平顯著上升，并且其表達(dá)水平與肝癌患者的OS相關(guān)，這進(jìn)一步證實(shí)HIF－2α參與了肝癌的發(fā)展。進(jìn)一步深入研究HIF－2α的功能及其作用機(jī)制，將對(duì)肝癌的治療具有十分重要的意義。

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