劉立新，高月林，王朝興，張羽男

（1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

隨著抗生素被大量使用，耐藥菌感染已成為21世紀(jì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨重大挑戰(zhàn)。近年來，臨床分離葡萄球菌中耐甲氧西林菌株（MRSA）檢出率越來越高，許多地區(qū)報道已超過80%，MRSA已成為感染重要病原菌，一旦發(fā)生流行，傳播迅速，難以控制[1]。因此，研制新抗菌藥物和逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性新型藥物制劑成為藥學(xué)研究領(lǐng)域亟待解決難題之一。

β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是MRSA獲得耐藥性機(jī)制之一，這種酶可抵抗具有β-內(nèi)酞胺環(huán)抗生素。研究發(fā)現(xiàn)[2]，含有黃酮類化合物中藥如黃連、柴胡、苦參、黃芪、野菊花等，與抗生素聯(lián)合應(yīng)用能增加耐藥菌對藥物敏感性。本試驗針對金黃葡萄球菌耐藥性，應(yīng)用體外抑菌試驗篩選對MRSA有抑制作用黃酮類化合物，通過測定β-內(nèi)酰胺酶活性來探討黃酮類化合物逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性機(jī)制，為研發(fā)新型細(xì)菌耐藥抑制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

耐甲氧西林金黃葡萄球菌菌株由佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供。

1.1.2 藥物

蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素（均購自南京青澤醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；黃連、柴胡、連翹等黃酮類化合物提取物（由佳木斯大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實驗室提供）；頭孢他啶（購自哈藥集團(tuán)制藥總廠）；克拉維酸（購自北京華業(yè)寰宇化工有限公司）。

1.1.3 試劑

蛋白胨、水解酪蛋白、牛肉浸膏、胰蛋白胨（均購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司）。

1.1.4 儀器

SW-CJ-2DD單人雙面凈化工作臺（購自蘇州凈化設(shè)備有限公司）；PYX-DH450電熱恒溫培養(yǎng)箱（購自上海璽恒實業(yè)有限公司）；Sunrise酶標(biāo)儀（購自帝肯公司）。

1.2 方法

1.2.1 耐藥菌株鑒定

1.2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

將供試菌從平板培養(yǎng)基上挑取單個菌落接種于2 mL MH培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)16～18 h，參照比濁管使其生長濁度達(dá)9×108個·mL-1。放入4℃冰箱備用。

1.2.1.2 MRSA鑒定[3]

將供試菌接種到M-H瓊脂平板上，再貼上1 μg苯唑青霉素紙片，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，抑菌環(huán)直徑≥13 mm為敏感菌，≤10 mm為耐藥菌。

1.2.1.3 生物學(xué)鑒定

按全國臨床檢驗操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)耐藥性試驗

1.2.2.1 最低抑菌濃度（MIC值）測定

采用試管二倍稀釋法，將耐藥菌液用MH培養(yǎng)液作1∶1 000稀釋，將蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素分別配置成濃度為1 mg·mL-1藥液，將黃連、柴胡、連翹中提取黃酮類化合物配置成濃度為2 mg·mL-1藥液，分別取7支試管，用菌液倍倍稀釋，37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果，以無細(xì)菌生長最低濃度為最低抑菌濃度。

1.2.2.2 藥敏試驗

將各種黃酮類化合物配制成低于最低抑菌濃度藥液，挑取耐藥性金黃葡萄球菌于各藥液中，37℃恒溫培養(yǎng)時間24 h后，接種于平板培養(yǎng)基上使其生長。挑取生長良好單個菌落制成菌液，用無菌棉簽均勻地涂布在M-H培養(yǎng)基上，待菌液稍干貼上苯唑青霉素藥敏紙片，同時用不經(jīng)逆轉(zhuǎn)耐藥金黃葡萄球菌作為陰性對照，經(jīng)克拉維酸逆轉(zhuǎn)作陽性對照。

1.2.3β-內(nèi)酰胺酶提取[4]

將耐藥金黃葡萄球菌接種于各種黃酮類化合物中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，4℃ 10 000 r·min-1離心10 min。沉淀用PBS洗滌兩次后，在-20～37℃反復(fù)凍融6次，4℃13 000 r·min-1離心60 min。留取上清液，為粗酶提取液，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.4β-內(nèi)酰胺酶活性測定[5]

頭孢他啶是β-內(nèi)酰胺酶最佳底物之一，β-內(nèi)酰胺酶活性單位用每mg蛋白在37℃，pH=7.0時每分鐘能水解底物毫克數(shù)表示。以100 mg·mL-1頭孢他啶為底物，在96孔板中加入0.20 mL PBS緩沖液，0.06 mL頭孢他啶，0.04 mL酶提取液，在波長482 nm處進(jìn)行時間掃描，根據(jù)OD值變化求酶活性。

1.2.5 對照試驗

選用克拉維酸作為陽性對照試驗，選用不經(jīng)逆轉(zhuǎn)處理菌株作為陰性對照實驗，其檢測方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥菌株鑒定

供試菌再貼上1 μg苯唑青霉素紙片，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，其抑菌環(huán)直徑為8.9 mm，生物學(xué)鑒定血漿凝固酶陽性，V-P陽性，麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸，DNA酶陽性。鑒定結(jié)果為MRSA菌株[6]。

2.2 MIC值測定結(jié)果

各種黃酮類化合物對耐藥金黃葡萄球菌最小抑菌濃度結(jié)果如表1。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

將各黃酮類化合物配制成低于MIC值濃度，分別為：蘆丁0.2 mg·mL-1，姜黃素0.2 mg·mL-1，槲皮素0.45 mg·mL-1，木犀草素0.45 mg·mL-1，黃連中黃酮類化合物0.6 mg·mL-1，柴胡中黃酮類化合物1.2 mg·mL-1，連翹中黃酮類化合物1.2 mg·mL-1，分別和耐藥金黃葡萄球菌作用一段時間后藥敏試驗結(jié)果如表2。

由表2可見蘆丁、姜黃素和槲皮素組與陰性對照組相比抑菌環(huán)直徑差異顯著（P＜0.05），說明逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性效果較好；與陽性對照組相比差異極顯著（P＜0.01）；與其他各黃酮類化合物組別效果不顯著（P＞0.05）。

表1 黃酮類化合物MIC值Table 1 MIC value of flavonoids compounds

表2 藥敏實驗結(jié)果Table 2 Medicine sensitive experiment results

2.4 β-內(nèi)酰胺酶活性測定結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，可選取蘆丁、姜黃素和槲皮素用于逆轉(zhuǎn)耐藥金黃葡萄球菌試驗，提取β-內(nèi)酰胺酶，測定酶活性，結(jié)果見表3。

表3 β-內(nèi)酰胺酶活性測定結(jié)果Table 3 Detection results of β-lactamase activity

由表3可見，經(jīng)蘆丁、姜黃素和槲皮素培養(yǎng)耐藥金黃葡萄球菌β-內(nèi)酰胺酶活性降低，與陰性對照組相比差異極顯著（P＜0.01）；與陽性對照組比較差異顯著（P＜0.05）；蘆丁、姜黃素和槲皮素各組間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

據(jù)報道MRSA由于其致病性強，己成為臨床抗菌感染治療難題之一，與艾滋病、乙型肝炎并列為世界三大嚴(yán)重感染性疾患[7]。目前，萬古霉素是治療MRSA感染最后一道防線，但臨床上己發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素金黃色葡萄球菌[8]。研究低毒、有效耐藥性抑制劑已在國際上引起廣泛關(guān)注。由于中藥具有無殘留、作用靶位多、有效成分多、作用范圍廣及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，因此從中藥中篩選耐藥抑制劑成為極具前景的研究方向，為解決細(xì)菌耐藥性難題開辟捷徑。目前，國內(nèi)外對于耐藥金黃葡萄球菌中藥耐藥抑制劑研究報道主要集中于單方中藥和復(fù)方中藥制劑上，而對于中藥有效成分逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性機(jī)制方面報道較少。

本試驗選取中草藥中普遍含有有效成分-黃酮類化合物為研究對象，其中包括純黃酮化合物，如蘆丁、姜黃素、槲皮素等；也包括不純黃酮類化合物提取物，如黃連中黃酮類化合物和柴胡中黃酮類化合物等。研究發(fā)現(xiàn)將耐藥金黃葡萄球菌分別接種于含以上黃酮類化合物培養(yǎng)液中作用一段時間后，金黃葡萄球菌恢復(fù)對抗生物敏感性，尤其以蘆丁、槲皮素和木犀草素效果明顯，而黃連和柴胡中黃酮類化合物效果不明顯。試驗結(jié)果說明黃酮類化合物能逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性，純黃酮類化合物逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性效果比粗提黃酮類化合物效果顯著。

β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性機(jī)制之一，其能將β-內(nèi)酰胺類抗生素水解成無抑菌活性產(chǎn)物，使細(xì)菌獲耐藥性[9]。部分中藥對目前臨床上產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶菌株具有逆轉(zhuǎn)耐藥性作用。黃通旺等應(yīng)用分光光度法測定大蒜、石芽茶等中草藥提取液對耐青霉素細(xì)菌所產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶抑制作用[10]。結(jié)果表明，大蒜、黃柏提取液對β-內(nèi)酰胺酶有不同程度抑制作用。三黃湯、黃連解毒湯、五味消毒飲對產(chǎn)酶大腸桿菌逆轉(zhuǎn)機(jī)制也是通過抑制ESBLs活性和表達(dá)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)效果[11]。何明等研究發(fā)現(xiàn)，肉湯菌經(jīng)雙黃連以及清開靈作用后細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶活性都降低[12]。本試驗選取藥敏試驗結(jié)果較好黃酮化合物蘆丁、姜黃素和槲皮素進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶活性研究，結(jié)果表明，將耐藥金黃葡萄球菌分別接種于含三種黃酮化合物培養(yǎng)液中作用一段時間后，β-內(nèi)酰胺酶活性降低，根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶活性測定結(jié)果，說明黃酮類化合物能抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，闡明黃酮類化合物逆轉(zhuǎn)金黃葡萄球菌耐藥性機(jī)制。

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