劉勝旺，張 玥，劉曉麗，李云霞，韓宗璽，邵昱昊，孔憲剛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽病研究室，哈爾濱 150001）

2010年初，在我國南方集中養(yǎng)鴨地區(qū)出現(xiàn)一種引起蛋鴨產(chǎn)蛋量下降的疾病。該病迅速傳播，在國內(nèi)其他養(yǎng)鴨地區(qū)鴨場相繼出現(xiàn)，涉及福建、浙江、廣西、廣東、江蘇、江西、安徽、河南、河北、北京、山東等地。該病導(dǎo)致鴨、蛋鴨產(chǎn)蛋量大幅度下降，肉鴨、育成鴨發(fā)生神經(jīng)癥狀，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。經(jīng)研究確定該病是由一種新的黃病毒感染引起。這種新的黃病毒隸屬于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒的恩塔亞病毒群，和坦布蘇病毒親緣關(guān)系最近，確定為一種新型鴨黃病毒-鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）[1-8]。2011年中國畜牧獸醫(yī)學會第一屆水禽疫病防控研討會將該病名稱統(tǒng)一為“鴨坦布蘇病毒病”。

鴨坦布蘇病毒（DTMUV）的病毒粒子呈球形，45～50 nm之間，有囊膜，表面有纖突[3,5,7]。基因組為單股正鏈RNA，含有一個開放閱讀框，編碼順序為5'UTR-C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR3'。其中有3種結(jié)構(gòu)蛋白C、PrM、E和7種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。

本研究對病料進行病毒分離，全基因測序。國際上通常以黃病毒NS5基因3'端長約1 kb的區(qū)域同源性作為黃病毒屬病毒分類依據(jù)。通過對實驗室分離株Du/CH/LSD/110128株全基因和NS5基因?qū)Ρ确治?，確定該株病毒屬于新型鴨坦布蘇病毒（DTMUV）。

1 材料與方法

1.1 病料來源主要材料

病料來自山東某發(fā)病鴨場；RNAiso Plus、One Step RT-PCR Kit Ver.2、pMD18-T載體、250 bp DNA Ladder Marker以及3'RACE快速擴增試劑盒等（購自寶生物工程（大連）有限公司）；DNA回收試劑盒（購自O(shè)MEGA公司）；0.22 μmol·L-1一次性濾器（購自Millipore公司）；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純；大腸埃希氏工程菌JM109由本實驗室保存。

1.2 動物

SPF鴨胚購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.3 病毒分離

對來自山東某發(fā)病鴨場病料進行研磨，加入PBS勻漿，-70℃反復(fù)凍融3次，8 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，用 0.22 μmol·L-1一次性濾器過濾除菌后將濾液裝于凍存管中備用。將濾液以0.1 mL·胚-1，接種于9～11日齡SPF鴨胚，37℃孵育，棄掉24 h以內(nèi)死亡胚，72 h后將接種鴨胚放入4℃，1 h后無菌收取尿囊液。

1.4 全基因序列測定分析

1.4.1 引物的設(shè)計合成

根據(jù)GenBank中登錄的鴨黃病毒BYD-1株（登錄號：JF312912）的序列[2,7]，及參考文獻[15]設(shè)計10對包含10條互相重疊片段的引物（見表1），由北京六合華大基因科技股份有限公司構(gòu)建。

表1 擴增引物Table 1 Primers for PCR in amplification

1.4.2 病毒RNA的提取

對收取的尿囊液進行病毒RNA提取，取200 μL鴨胚尿囊液，按RNAiso說明書提取RNA，最后用30 μL DEPC水溶解沉淀。通過RT-PCR方法判定病毒分離是否成功。引物使用鴨黃病毒（Flavivirus）的特異性引物，DFLA-F:AGACTGCTG GTGCAATGAGAC和DFLA-R:CGTCGTTCCCAGAT TCCA[1]。預(yù)期擴增片段長度250 bp，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 病毒全基因組克隆

將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性病毒RNA使用已設(shè)計的10對引物進行RT-PCR，產(chǎn)物根據(jù)OMEGA公司膠回收試劑盒說明書回收目的片段。使用常規(guī)方法重組質(zhì)粒，篩選出陽性質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定。

1.4.4 基因組序列分析

將測得序列通過DNASTAR、BioEdit等軟件進行拼接分析，所得序列在GenBank中進行BLAST同源序列比對，用MEGA5軟件采用鄰近法分別對Du/CH/LSD/110128株與其他黃病毒科病毒進行全基因發(fā)育進化樹和NS5基因發(fā)育進化樹構(gòu)建。并用MegAlign對全基因組和NS5基因進行同源性比對。從GenBank下載參考序列的毒株（見表2）,從GenBank下載NS5基因參考序列的毒株（見表3）。

表2 從GenBank下載參考序列的毒株及其縮寫Table 2 Reference viruses in GenBank and their abbreviation

表3 從GenBank下載參考序列的毒株及其縮寫（NS5）Table 3 Reference viruses in GenBank and their abbreviation(NS5)

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離

尿囊腔接種后72 h的胚體有明顯出血點，頸背部出血點明顯（見圖1），對收獲的鴨胚尿囊液提取RNA經(jīng)RT-PCR擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測在250 bp處有明顯條帶。

圖1 鴨胚出血（頸背部出血點）Fig.1 Duck embryo bleeding(neck and back with petechia)

2.2 全基因組擴增結(jié)果

將分離到的病毒使用上述10對引物通過RT-PCR擴增得到10條相互重疊的片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小與預(yù)測基本相符（見圖2）。

圖2 全基因組擴增Fig.2 Whole genome amplification

2.3 全基因片段分析

本試驗測得的Du/CH/LSD/110128株基因含有一個開放閱讀框，編碼3 426個氨基酸組成的多聚蛋白，其中3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、PrM、E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5），與已知的坦布蘇病毒屬病毒基因相似。各個蛋白在基因中的位置組成（見表4），參照已發(fā)表文獻中已知序列多聚蛋白的切割方法[9-11]，經(jīng)比較可得出各個蛋白的切割位點基本保守。

表4 Du/CH/LSD/110128全基因組結(jié)構(gòu)Table 4 Full-length genome organization of Du/CH/LSD/110128

2.3 全基因系統(tǒng)進化分析結(jié)果

將本試驗分離到的Du/CH/LSD/110128株全基因序列與其他23株黃病毒科病毒進行基因核苷酸同源性比對，比對結(jié)果（見表5），并采用鄰近法對它們進行遺傳進化樹的構(gòu)建（見圖3）。

2.4 NS5基因分析

對試驗分離株Du/CH/LSD/110128與GenBank上已公布的其他32株病毒的NS5基因進行核苷酸序列同源性比對。

結(jié)果見表6和圖4。

表5 Du/CH/LSD/110128（NS5）與其他GenBank已公布序列核苷酸同源性比較Table 5 Comparison of Du/CH/LSD/110128(NS5)with reference viruses in GenBank for nucleotide

圖3 鴨坦布蘇病毒DU/CH/LSD/110128株系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of DTMUV DU/CH/LSD/110128 strain

表6 Du/CH/LSD/110128株與其他GenBank已公布序列核苷酸同源性比較Table 6 Comparison of Du/CH/LSD/110128 with reference viruses in GenBank for nucleotide

圖4 鴨坦布蘇病毒Du/CH/LSD/110128株NS5基因系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of DTMUV Du/CH/LSD/110128 strain NS5 gene

3 討論與結(jié)論

鴨黃病毒病最早于1995年出現(xiàn)在河北省石家莊、邯鄲等地，首次鑒定該病的病原為黃病毒科的鴨病毒性腦炎病毒，國外未見報道[11]。2010年初開始，在我國大部分集中養(yǎng)鴨地區(qū)爆發(fā)。該病迅速傳播，患病鴨多出現(xiàn)腳麻痹、頭頸歪斜等運動機能失調(diào)等神經(jīng)癥狀，產(chǎn)蛋量急劇下降，表現(xiàn)為出血性卵巢炎癥狀[1-8]，臨床易與禽流感新城疫混淆，建立靈敏準確的實驗室診斷該病的方法非常重要，顏丕熙等建立的套式RT-PCR方法，靈敏度比常規(guī)PCR高10倍，臨床樣品陽性檢出率高于病毒分離率[14]。Yan等建立了TaqMan探針熒光定量PCR方法，靈敏度是常規(guī)PCR的100倍[16]。截至目前尚沒有可有效防治DTMUV的商品化疫苗研制成功，感染DTMUV后病鴨產(chǎn)生的抗體效價較低[3,7-8]，雞亦可對DTMUV產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。篩選出抗原性良好的天然疫苗株對進一步研究開發(fā)效果確實的滅活苗和弱毒苗有至關(guān)重要作用。

對黃病毒的分類，國際上公認分類方法是病毒NS5基因核苷酸同源性在84%以上的分離株為同一個種病毒[13]。本試驗對病料進行病毒分離檢測和全基因組序列測定分析，確定Du/CH/LSD/110128株病毒含有一個開放閱讀框，編碼一個由3 426個氨基酸組成的多聚蛋白，主要包含3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白，其中有一個囊膜蛋白E和一個與RNA相連的核心蛋白C，以及一個較大的前體蛋白PrM。緊接著是非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，為一種糖蛋白，以及NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5[17]。通過對試驗分離株Du/CH/LSD/110128與GenBank已公布的一些黃病毒科病毒的基因序列進行核苷酸同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)試驗分離株Du/CH/LSD/110128與黃熱病毒（Yellow fever virus）、登革熱病毒（Dengue virus）、伊利烏斯腦炎病毒（Ilheus virus）、西尼羅病毒（West Nile virus）、巴格扎病毒（Bagaza virus）和坦布蘇病毒（Tembusu virus）具有遺傳進化關(guān)系。其中與黃熱病毒（Yellow fever virus）親緣關(guān)系最遠，與巴格扎病毒（Bagaza virus）親緣關(guān)系較近但遺傳距離介于病毒種的水平上。與其他株坦布蘇病毒親緣關(guān)系最近，全基因組核苷酸同源性和NS5基因核苷酸同源性均在87%以上，可以確定試驗分離株Du/CH/LSD/110128屬于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒恩塔亞病毒群的坦布蘇病毒。

黃病毒可引起人類和動物嚴重疾病，禽源司提阿萬病毒（Sitiawan virus）只對家禽致病不變。傳統(tǒng)坦布蘇病毒被庫蚊這種傳播途徑所隔離，但新型的鴨坦布蘇病毒可對各種鴨致病，其中包括北京鴨、櫻桃谷鴨、紹興鴨[10]。李澤君研究表明該病可以通過直接接觸傳播和空氣傳播[13]，這與其他坦布蘇病毒存在區(qū)別。鴨坦布蘇病毒對鳥類和人類的致病性尚不清楚，其生理和生態(tài)動力學包括病毒周期也不甚了解。還需要更深入研究以揭示鴨坦布蘇病毒本質(zhì)、生理生態(tài)學及致病性等。

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