劉金玲，單風(fēng)平

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866；2.中國醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，沈陽 110001）

樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）是目前所知機體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細胞，參與機體多種自身免疫性疾病、免疫缺陷病、腫瘤及炎癥反應(yīng)病理過程，在機體抗感染免疫及腫瘤免疫應(yīng)答過程中起著有重要作用[1]。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）是一種模式識別受體，在細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，是聯(lián)系天然免疫與獲得性免疫橋梁。研究表明，TLR4（Tol-l like receptor 4）可直接或間接結(jié)合病原體，通過細胞吞噬和內(nèi)化活動，將病原體及其產(chǎn)物清除，還可誘導(dǎo)防御素和NO表達，因此TLR4在天然免疫中起重要作用[2-4]。

腫 瘤壞死因子-a（Tumor Necrosis Factor-a，TNF-a）是一種主要由活化單核巨噬細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生多效性細胞因子，主要作用于免疫細胞調(diào)節(jié)，可誘導(dǎo)細胞凋亡，炎癥反應(yīng)及抑制腫瘤和病毒復(fù)制，在疾病感染過程中有重要監(jiān)測意義[5-6]。蛋氨酸腦啡肽（Methionine Enkephalin，MENK）聯(lián)系神經(jīng)、免疫兩大系統(tǒng)，是重要細胞因子，具有獨特生物學(xué)活性，機體免疫細胞表面廣泛存在其受體[7-8]，MENK通過與受體相互作用增強天然免疫系統(tǒng)細胞如自然殺傷細胞、單核細胞、巨噬細胞和獲得性免疫系統(tǒng)細胞如T細胞活性，促進細胞因子釋放等，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用[9]。

關(guān)于MENK對樹突狀細胞功能研究，國內(nèi)外鮮有報道，本試驗通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓來源樹突狀細胞，觀察蛋氨酸腦啡肽對GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓來源樹突細胞表達TLR-4和TNF-α影響，探明TLR4和促炎癥因子TNF-α表達變化情況，從而探討蛋氨酸腦啡肽對樹突狀細胞免疫功能作用調(diào)節(jié)機制，為臨床研究提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周C57BL/6小鼠（購自上海實驗動物研究所）；RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺）、胎牛血清（購自Hyclone公司）；熒光素標(biāo)記的小鼠單抗：CD11c-FITC（購自Biolegend公司）；重組小鼠GM-CSF（rmGM-CSF），IL-4（購 自 Biolegend 公司）；分裝后于-20℃保存?zhèn)溆?；蛋氨酸腦啡肽（MENK）由中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室提供；RT-PCR Kit、TRIzol、瓊脂糖（購自TaKaRa公司）；兔抗鼠TNF-α，兔抗鼠TLR-4多克隆抗體、SABC、DAB顯色試劑盒（購自武漢博士德公司）；二抗IgG-HRP（購自美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

將7～8周齡的正常C57BL/6鼠頸椎脫位處死，無菌條件下取完整股骨、脛骨，用RPMI-1640培養(yǎng)液將骨髓細胞沖出，收集骨髓細胞懸液經(jīng)離心，紅細胞裂解再次離心后將細胞用RPIM1640培養(yǎng)基懸浮，分裝6孔培養(yǎng)板，每孔106個·mL-1。每孔中別加入不同誘導(dǎo)劑置于含5%CO2，飽和濕度，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天半量換液，并用倒置顯微鏡觀察不同時間點樹突狀細胞形態(tài)變化。

1.2.2 試驗分組

在培養(yǎng)的過程中，將細胞分為如下各組，施以不同的刺激條件。①RPMI-1640空白對照組；② GM-CSF（10 ng·mL-1）、 IL-4（5 ng·mL-1）和MENK （10～12 mol·L-1）共刺激組（MENK+G+I）；③ GM-CSF（10 ng·mL-1）和 IL-4（5 ng·mL-1）組（G+I）。培養(yǎng)至第7天，用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細胞，經(jīng)流式細胞儀鑒定BM-DCs的純度。

1.2.3 RT-PCR法檢測樹突狀細胞TLR-4和TNF-αmRNA的表達

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物，引物均由TaKaRa公司合成，PCR引物見表1。

1.2.3.1 細胞總RNA的提取

各組細胞加入TRIzol裂解液，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加入0.2 mL氯仿，離心，吸取上層水相，加等量的異丙醇沉淀RNA，離心，緩慢加人750 μL乙醇洗滌，離心，空氣風(fēng)干后加入DEPC水溶解。紫外分光光度計測定波長260及280 nm RNA A值，計算RNA的濃度和純度，取0.5 μg RNA用于RT-PCR。

1.2.3.2 cDNA合成

20 μL 體系中含，10×RT Buffer 2 μL，MgCl2（25 mmol·L-1） 4 μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）1 μL，Oligo（dT）-Adaptor Primer 1 μL（2.5 pmol·μL-1）， RNase Free dH2O 6.5 μL，總RNA樣本1 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL（5 U·μL-1）。反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，65℃ 50 min，95℃ 5 min，5℃ 5 min。

表1 PCR引物Table 1 PCR primer

1.2.3.3 半定量RT-PCR

在 25 μL 體系中含 RNase Free dH2O 12.5 μL，5×PCR Buffer 5 μL，TNF-α，TLR-4及β-actin的上下游引物各 0.5 μL，cDNA 5 μL，Taq酶 0.5 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）1 μL。循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min 4℃保存。

各組取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在Gelpro32凝膠成像系統(tǒng)上進行分析，以各組目的基因條帶和相應(yīng)β-actin條帶光密度的比值作為相應(yīng)基因mRNA的相對定量表達水平。

1.2.4 ELISA法檢測樹突狀TNF-α蛋白的表達

每組做4個復(fù)孔。各組處理結(jié)束后收集培養(yǎng)液于酶標(biāo)板，37℃孵育2 h，PBS清洗2次，加鼠源TNF-α抗體 100 μL·孔-1，37 ℃孵育 2 h，洗板 3次，加抗鼠HRP-IgG 100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h，洗板，分別加顯色液A和B各50 μL·孔-1，37℃孵育 15 min，加終止液 100 μL·孔-1。酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度。

1.2.5 Western-Blot檢測TLR-4蛋白的表達

收集各組培養(yǎng)的成熟的BM-DC，加入2×SDS裂解后，取50 μg蛋白質(zhì)樣品加入到樣品孔中進行SDS聚丙烯酸胺凝膠電泳，然后根據(jù)凝膠面積按300 mA接通電流進行轉(zhuǎn)膜、封閉、兔抗鼠TLR-4一抗孵育過夜，兔抗鼠IgG-HRP抗體（1∶2 000稀釋），孵育2 h，最后用DAB顯色劑進行顯色。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS（17.0）統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BM-DCs純度的流式細胞儀鑒定

取各誘導(dǎo)組細胞懸液0.1 mL至流式管中，加入熒光標(biāo)記的CD11c-FITC，混勻，4℃避光染色，洗滌后上機檢測，結(jié)果顯示MENK+G+I組樹突狀細胞的純度為95.09%，高于G+I組（90.89%），而1640對照組的純度只有9.08%。表明MENK在體外能夠增加骨髓來源樹突狀細胞的誘導(dǎo)純度（見圖1）。

圖1 各組樹突狀細胞純度流式分析Fig.1 Purity analysis of DCs by FCM

2.2 MENK對GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)的骨髓來源樹突狀細胞TNF-α和TLR-4mRNA的影響

RT-PCR結(jié)果表明經(jīng)MENK與GM-CSF和IL-4（MENK+G+I）協(xié)同誘導(dǎo)骨髓來源樹突狀細胞TNF-α和TLR-4 mRNA的表達均增多，其中TLR-4 mRNA豐度值與1640對照組相比具有極顯著性差異（P＜0.01），與GM-SCF和IL-4（G+I）誘導(dǎo)組相比差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而TNF-αmRNA豐度值（大于1640對照組，差異極顯著（P＜0.01），與G+I組相比差異顯著（P＜0.05)。上述數(shù)據(jù)表明MENK可以從基因水平上調(diào)樹突狀細胞TNF-α和TLR-4的表達（見圖2、3）。

圖2 各組骨髓來源樹突狀細胞TNF-α和TLR-4 mRNA表達的RT-PCR結(jié)果Fig.2 RT-PCR analysis at mRNA levels of of TNF-α and TLR-4 for BM-DCs

圖3 各組骨髓來源樹突狀細胞TNF-α和TLR-4 mRNA表達的RT-PCR結(jié)果Fig.3 Analysis of histogram at abundance of TNF-α and TLR-4 for BM-DCs

2.3 MENK對GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)的骨髓來源樹突狀細胞TNF-α蛋白表達的影響

結(jié)果表明，與RPMI1640對照組相比，MENK+G+I組中TNF-α水平有極顯著提高（P＜0.01）；與G+I組相比差異顯著（P＜0.05），數(shù)據(jù)表明，MENK可上調(diào)的細胞因子TNF-α，MENK-12定向誘導(dǎo)Th1型細胞反應(yīng)（見表2）。

表2 MENK對G+I誘導(dǎo)骨髓來源樹突裝細胞TNF-α表達的影響Table 2 Effect of MENK on TNF-α of BM-DCs induced by GM-CSF and IL-4

2.4 MENK對GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)的骨髓來源樹突狀細胞TLR-4蛋白表達的影響

收集不同誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)的成熟的BM-DCs，提取蛋白質(zhì)后，采用Western-Blot方法從蛋白水平檢測BM-DCs TLR-4的表達情況。結(jié)果表明，MENK+G+I組誘導(dǎo)培養(yǎng)的BM-DCs其TLR-4蛋白的表達豐度明顯高于RPIM-1640對照組，差異極顯著（P＜0.01），高于G+I組，差異顯著（P＜0.05），提示MENK可上調(diào)BM-DCs TLR-4蛋白的表達（見圖4）。

圖4 體外誘導(dǎo)骨髓來源樹突狀細胞TLR-4的表達Fig.4 Expression of TLR-4 of BM-DCs in vitro

3 討論與結(jié)論

DC是免疫應(yīng)答啟動因子和調(diào)節(jié)因子，是T、B細胞有效刺激因子。近年來，DC在機體免疫系統(tǒng)中重要作用顯現(xiàn)，在移植排斥反應(yīng)、腫瘤免疫治療、感染性疾病和自身免疫性疾病等的診治方面均有研究報道，同時對DC生物學(xué)特性、與某些疾病發(fā)生、預(yù)后等關(guān)系也有進一步深入研究[10-11]。成熟DC表達高水平的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子，并能分泌白細胞介素-l（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、干擾素-a（IFN-α）、腫瘤壞死因子a（TNF-a）等細胞因子[12]，其中TNF-α是TNF家族重要成員之一，是具有廣泛生物學(xué)活性的細胞因子，能誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生導(dǎo)致細胞凋亡[13]。

Toll樣受體是一種模式識別受體，廣泛分布在免疫細胞表面，在細胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，是聯(lián)系天然免疫與獲得性免疫的橋梁，能特異性地識別病原體相關(guān)分子模式，激發(fā)動物天然免疫和獲得性免疫的早期免疫反應(yīng)，這種特性使Toll樣受體成為誘導(dǎo)有效免疫反應(yīng)對抗病原或自身異常重要候選基因，而Toll樣受體4（TLR-4）是機體對革蘭氏陰性菌表達的脂多糖應(yīng)答的主要受體，TLR-4活化后，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，可引起TNF-α、NO等多種炎癥介質(zhì)和細胞因子的表達和釋放[14]，并激活獲得性免疫，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

MENK是一類聯(lián)系神經(jīng)、免疫兩大系統(tǒng)，通過作用到免疫細胞阿片受體上發(fā)揮生物學(xué)活性細胞因子。Burger等證實MENK具有增強NK細胞活性、刺激的T細胞增殖、顯著增強CTL細胞活性[15]、刺激大鼠腹腔巨噬細胞H2O2和NO產(chǎn)生，協(xié)助巨噬細胞殺菌和抗腫瘤、調(diào)控IL-2、IL-1、IL-4和IFN-γ等細胞因子分泌及抑制細胞生長功能。MENK對免疫系統(tǒng)的調(diào)控功能已被大量體外、體內(nèi)試驗所證實[16]。

本試驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)MENK刺激后，骨髓來源樹突狀細胞純度為95.09%，高于1640對照組和G+I組，而且TLR-4和TNF-α表達在基因水平和蛋白水平均顯著增加，與其他試驗組相比差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。TNF-α處于炎癥級反應(yīng)中心環(huán)節(jié)，是TLR4/NF-κB信號通路中下游信號，TNF-α表達量多少是MENK發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用進而干預(yù)腫瘤、病毒發(fā)生、發(fā)展的靶分子之一。

本試驗結(jié)果提示，在MENK誘導(dǎo)作用下BM-DC增加阿片受體表達，從而上調(diào)TLR-4表達。這一現(xiàn)象與活化后DCs在亞群、表型和細胞因子分泌模式等方面差異性有關(guān)，但其確切機理尚待進一步闡明。綜上，樹突細胞表面的阿片受體是介導(dǎo)小鼠DCs活化的重要模式識別受體，間接通過上調(diào)TLR-4表達從而激活NF-κb信號通路，上調(diào)Th1型細胞因子TNF-α等表達，誘導(dǎo)Th1細胞反應(yīng)，進一步深入探討MENK對樹突狀細胞免疫功能調(diào)控影響，為揭示MENK抗疾病作用機制提供試驗依據(jù)。

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