李德山，曹榮邱，高華山，任桂萍，劉明瑤

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

成纖維細胞生長因子（FGF），家族共有22名成員，分別通過與細胞膜上四種FGF受體（FGFR）結合，激活下游信號傳導通路而起到各自生物學作用。FGF家族成員為150～300個氨基酸組成的多肽，成員間同源性約為30%～60%[1]。FGF21是FGF19亞家族新成員，最早由Nishimura等發(fā)現(xiàn)，肝臟[1]、脂肪[3]和骨骼肌[4]為主要表達器官或組織[2]。FGF21由于其獨特代謝調節(jié)功能，一直是代謝疾病研究熱點，其功能主要表現(xiàn)在能促進脂肪細胞糖吸收[5]，研究表明FGF21可不依賴胰島素降低血糖。FGF21可改善胰島β細胞功能，促進胰島素分泌，增強靶細胞對胰島素敏感性。嚙齒類動物及靈長類動物2型糖尿病模型和飲食誘導肥胖小鼠模型上研究[6-7]表明，F(xiàn)GF21可降低血糖及甘油三酯水平，增加脂肪消耗并抑制脂肪合成，逆轉肝脂肪變性及胰島素抵抗，并能起到減肥作用。FGF21在治療代謝疾病特別是糖尿病方面具有廣闊市場前景。研究發(fā)現(xiàn)FGF21在大腸桿菌中表達量低且主要以包涵體形式表達，嚴重制約FGF21成藥可能性[8-9]。

任何一種具有應用價值蛋白質和多肽可通過蛋白質工程進行改造以提高其活性、特異性和穩(wěn)定性，降低免疫原性和毒副反應，延長在體內半衰期等。何昆等在FGF21C端添加兩個精氨酸提高FGF蛋白穩(wěn)定性和表達量，而國內外研究運用定點突變技術對FGF21進行改造的文獻很少[10]。

本研究對比FGF21及FGF家族其他成員氨基酸序列，根據(jù)FGF21與同源序列差異，用基因突變方法，對FGF21氨基酸進行定點突變，構建mutFGF21基因，成功實現(xiàn)其在大腸桿菌中高水平可溶性表達，并對其生物學活性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 載體和菌株

表達載體pSUMO-FGF21及表達菌株、擴增用大腸桿菌DH5α及表達用菌Rosetta（DE3）均為東北農(nóng)業(yè)大學生命中心生物制藥實驗室保存；PCR克隆產(chǎn)物擴增載體pMD18-T vector購自TAKARA公司。

1.2 酶和主要試劑

DpnI， Primer Star DNA polymerase， dNTP Mixture，IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）（均購自TAKARA公司）；AxyPrep質粒DNA小量提取試劑盒，AxyPrep DNA膠回收試劑盒，AxyPrep PCR清潔試劑盒（均購自Axygen公司）；填料Ni Sepha?rose 6 Fast Flow及預裝柱HiPrepTM 26/10 Desalting（均購自GE公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)質胎牛血清（FBS）、新生牛血清（NCS）（均購自Invitrogen Corporation公司）；Insulin和牛血清白蛋白（均購自Sigma公司），葡萄糖檢測試劑盒（購自四川邁克科技有限責任公司）；SUMO蛋白酶、兔抗人FGF21多克隆抗體由本實驗室制備；辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（羊抗兔IgG）（購自Santa Cruz Bio?technology）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 FGF家族氨基酸序列比較

FGF1（UniProtKB/Swiss-Prot:P05230.1），F(xiàn)GF2（UniProtKB/Swiss-Prot:P09038），F(xiàn)GF4（UniProtKB/Swiss-Prot:P08620.1）， FGF10（UniProtKB/Swiss-Prot:O15520.1）,FGF17（UniProtKB/Swiss-Prot:O602 58）,FGF19（UniProtKB/Swiss-Prot:O95750）,FGF21（UniProtKB/Swiss-Prot:Q9NSA1）及 FGF23（UniProt KB/Swiss-Prot:9GZV9）序列檢索自UniProt數(shù)據(jù)庫。序列比對采用DNAMAN軟件。

通過序列對比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21第141位氨基酸為G，是一個親水極性氨基酸；而該位點FGF家族其他成員保守氨基酸為F或M，是疏水非極性氨基酸。本試驗將G變成F，使FGF21在表達時更易形成疏水核心，蛋白結構更緊密，提高其在大腸桿菌中穩(wěn)定性，從而增加FGF21產(chǎn)量。

采用生物信息軟件DNASTAR對mutFGF21和hFGF21氨基酸序列進行二級結構預測，二者預測結果進行比較。根據(jù)hFGF21基因序列在突變位點附近設計一對互補引物：Forward：5'CTCGCTTCC TGCCACTACCATTCCTGCCCCCCGCACTCCCG 3'，Reverse：5'CGGGAGTGCGGGGGG CAGGAATGG?TAGTGGCAGGAAGCGAG 3'，下劃線部分為突變位置。采用定點突變方法PCR（Polymerase Chain Reaction，多聚酶鏈式反應）擴增環(huán)狀pSUMO-FGF21表達載體。PCR純化產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ核酸內切酶酶切，消化掉模板鏈。取5 μL酶切產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)菌，涂布于含100 μg·mL-1Amp抗性LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12～16 h。隨機挑取單菌落，接種于含100 μg·mL-1AmpLB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質粒。重組質粒樣品由寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定。

1.4 SUMO-mutFGF21融合蛋白表達

鑒定正確pSUMO-mutFGF21轉化Rosetta表達菌，培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于含100 μg·mL-1AmpLB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。取上述過夜培養(yǎng)菌液以1%比例接種于含100 μg·mL-1Am?pLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2～3 h，當OD600至 0.4～0.6時，加 IPTG 至終濃度 0.25 mmol·L-1，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 h取1 mL菌液4℃?zhèn)溆?。收集菌體用PBS重懸，超聲破碎進行SDS-PAGE分析mutFGF21融合蛋白表達量與時間關系。對照組為不加IPTG培養(yǎng)3 h菌體。

1.5 mutFGF21可溶性表達分析及與hFGF21表達量比較

mutFGF21表達菌37℃搖瓶培養(yǎng)3 h后加入IPTG至終濃度0.25 mmol·L-1，誘導3 h收集菌體，破碎后菌體離心取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析表達蛋白包涵體情況。mutFGF21和hFGF21表達菌37℃搖瓶培養(yǎng)至OD為0.4，加入終濃度為0.25 mmol·L-1IPTG繼續(xù)培養(yǎng)誘導3 h，取1 mL菌液收集菌體，超聲破碎后離心取上清進行SDS-PAGE，上樣量均為40 mL。

1.6 mutFGF21蛋白純化

表達菌株擴大培養(yǎng)，收集菌體超聲波破碎后，2 000 g，40 min離心收集上清。運用AKTA purifier 100純化系統(tǒng)，收集上清經(jīng)HisTrapTM FF crude親和層析柱純化SUMO-mutFGF21融合蛋白，用HiPrepTM 26/10 Desalting柱脫鹽后加入SUMO蛋白酶，將SUMO標簽切除。酶切后經(jīng)HisTrapTM FF crude親和層析純化mutFGF21成熟蛋白。SDSPAGE分析蛋白純化情況。

1.7 Western blot分析mutFGf21免疫特異性

將純化后mutFGF21蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉膜至硝酸纖維膜進行Western blot；5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗人FGF21多克隆抗體為一抗（1∶500稀釋）孵育過夜，洗滌，羊抗兔HRP標記IgG抗體為二抗（1∶7 500稀釋）孵育1 h，洗滌，加入化學發(fā)光底物Super Signal檢測試劑（Pierce）后，暗室X光片暗匣曝光、顯影。

1.8 mutFGF21蛋白生物學分析

取生長狀態(tài)良好HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶消化液消化，離心收集細胞，按照2.5×104密度將細胞接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為200 μL·孔-1。當細胞長成均勻單層時，把原培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基饑餓12 h后，分別加入濃度分別為0.2，2，20 mg·L-1FGF21成熟蛋白和mutFGF21成熟蛋白200 μL，每個處理重復3次，24 h后取細胞培養(yǎng)上清液2 mL用GOD-POD法檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量[11]，用Excel軟件分析試驗結果，組間比較采用t檢驗。

培養(yǎng)基中殘留葡萄糖含量計算公式為：

葡萄糖濃度（mmol·L-1）=OD樣品/OD標準×5.55 mmol·L-1

計算葡萄糖消耗率公式為：

葡萄糖消耗率（%）=[（C空白葡萄糖-C給藥葡萄糖）/C空白葡萄糖]×100%。

2 結果與分析

2.1 mutFGF21與野生型FGF21二級結構預測結果比較

采用DNASTAR軟件對mutFGF21和野生型FGF21氨基酸序列進行二級結構預測，所用方法為Garnier-Robson Method。二者預測結果如圖1所示。比較發(fā)現(xiàn)氨基酸序列從140位至158位除α螺旋外二級結構均發(fā)生變化（兩豎線間區(qū)域所示），與此同時，其他部位均未發(fā)生改變。變化主要有β折疊、轉角、無規(guī)則卷曲位置變化、增加一個無規(guī)則卷曲及柔性區(qū)域減少等。

2.2 pSUMO-FGF21基因定點突變

采用定向突變方法擴增環(huán)狀pSUMO-FGF21表達載體，將PCR擴增產(chǎn)物進行純化，純化PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI核酸內切酶酶切，消化掉模板鏈，酶切產(chǎn)物取樣轉化DH5α，挑單菌落提質粒鑒定測序，測序結果發(fā)現(xiàn)第421和422位核苷酸GG突變?yōu)門T，相應氨基酸序列第141位G突變?yōu)镕，與試驗設計一致。

圖1 hFGF21和mutFGF21二級結構預測結果比較Fig.1 Comparison of secondary structure prediction results of hFGF21 and mutFGF21

2.3 SUMO-mutFGF21融合蛋白表達

將陽性菌在37℃，0.25 mmol·L-1IPTG條件下，誘導培養(yǎng)，SUMO-mutFGF21表達菌株誘導3 h后菌體經(jīng)超聲破碎離心后，分別取沉淀和上清進行電泳，結果分析表明融合蛋白大部分以可溶形式存在，見圖2。

圖2 SUMO-mutFGF21融合蛋白可溶性分析Fig.2 Analysis of the portion of soluble SUMO-mutFGF21 fusion protein

mutFGF21和hFGF21表達菌株37℃均培養(yǎng)至OD為0.4，加入相同濃度IPTG繼續(xù)誘導3 h，然后取相同濕重菌體，用等體積PBS重懸后超聲破碎，進行SDS-PAGE，上樣量均為40 mL。結果見圖3，灰度值分析顯示mutFGF21蛋白產(chǎn)量比hFGF21提高50%。

圖3 hFGF21和mutFGF21產(chǎn)量比較Fig.3 Yield comparison of hFGF21 and mutFGF21

2.4 mutFGF21蛋白純化

大量培養(yǎng)后收集菌體經(jīng)超聲破碎后，12 000 g，離心30 min，收集菌體，超聲破碎后取上清。上清通過AKTApurifier 100系統(tǒng)經(jīng)過HisTrapTMFF crude親和層析，用Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰，得到純度較高融合蛋白。融合蛋白通過HiPrepTM26/10 Desalting柱buffer置換，加入SUMO蛋白酶進行酶切。酶切后產(chǎn)物，經(jīng)HisTrapTM FF crude親和層析，收集流穿峰，15%SDS-PAGE電泳檢測純化情況。表明經(jīng)過兩次親和層析，得到mutFGF21其分子質量為20 ku，與mutFGF21蛋白理論值19.4 ku相差不大。見圖4。

2.5 Western blot分析

純化后成熟mutFGF21蛋白經(jīng)Western blot檢測證明，1號泳道m(xù)utFGF21能與兔抗hFGF21抗體發(fā)生特異性反應（見圖5）。

2.6 mutFGF21蛋白活性分析

用不同濃度mutFGF21和hFGF21蛋白分別處理HepG2細胞24 h后，與對照相比，兩種蛋白處理HepG2細胞葡萄糖消耗率顯著增加，并且隨著蛋白濃度增加而增加，呈劑量依賴關系。說明mut?FGF21蛋白同hFGF21蛋白一樣具有調節(jié)細胞葡萄糖代謝作用；另外，mutFGF21細胞活性與hFGF21相比，略有提高，但不具有統(tǒng)計學意義，如圖6所示。

圖6 mutFGF21和hFGF21糖吸收活性比較Fig.6 Comparison of glucose uptake efficiency in of mutFGF21 and hFGF21 protein

3 討論與結論

FGF21是一類重要糖脂代謝調節(jié)因子，可有效調節(jié)血液中葡萄糖和甘油三脂水平，抑制肝臟生酮作用，改善脂譜。FGF21作為潛在糖尿病治療藥物，不會像FGF1、FGF2等誘發(fā)癌癥，與傳統(tǒng)藥物胰島素相比，具有療效持久、無低血糖、無體重增加等優(yōu)勢。FGF21目前主要以大腸桿菌為宿主生產(chǎn)，但產(chǎn)量較低。因此急需通過蛋白質工程手段對FGF21進行改造，提高其表達量。

蛋白質工程改造蛋白首先是靶位點選擇，分子設計不精確性、盲目性使被改進實用蛋白質不多，多數(shù)成果集中于理論和技術。本研究通過FGF21與FGF家族其他成員間氨基酸序列比對，從同源序列差異入手進行試驗設計，獲得較好結果。從這一出發(fā)點改造FGF21，有利于了解其對空間結構和生物活性影響。

FGF家族成員間氨基酸序列同源性約為30%～60%，其中高度保守氨基酸序列對蛋白質功能影響較大，其中核心區(qū)第5個氨基酸Y，第84個氨基酸Y，第121位氨基酸L，對蛋白質功能影響最大，這在FGF4突變中已得到證實。通過對比FGF1-FGFR1、FGF2-FGFR1、FGF2-FGFR2晶體結構發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR與FGF結合位點在D2（FGFRIg樣結構域2）和D2-D3linker區(qū)域。通過重疊FGF4晶體結構到FGF2-FGFR1結構上，得到一個FGF4-FGFR1模型，在FGF4-D2表面，發(fā)現(xiàn)FGF4上87位Y、166位Y，203位L被FGFR1D2上幾個疏水氨基酸包圍[12]。為驗證這種相互作用的正確性，Bellostap等突變FGF4 87位Y、166位Y，203位L為A，發(fā)現(xiàn)FGF4在受體親和力，以及促進DNA合成方面都降低超過100倍，驗證結構正確性[13]。因此，推斷FGF家族中保守氨基酸序列發(fā)生變化將對功能產(chǎn)生影響。通過序列對比發(fā)現(xiàn)FGF家族中一個保守區(qū)域內其中一個氨基酸與FGF21不同，因此通過定點突變該氨基酸以研究其對FGF21表達量影響。

FGF家族成員具有120個氨基酸構成11（內分泌FGFs）或12（旁分泌FGFs）個β片層結構組成“β-trefoil”結構，這一保守區(qū)側翼連接不同N端和C端賦予FGF家族成員特異生物活性[13]。該核心結構決定于18個大疏水殘基，與蛋白穩(wěn)定性有關。與FGF21一樣，F(xiàn)GF1存在穩(wěn)定性差、體內半衰期短問題，Brych等在FGF1該同源區(qū)內進行定點突變，得到穩(wěn)定性增加FGF1突變蛋白[14]。本試驗所嘗試突變位點位于該保守結構內，把G突變?yōu)镕，增加核心結構疏水性，使多肽在折疊時更易形成疏水核心，減少不穩(wěn)定蛋白產(chǎn)生，同時蛋白結構更緊密，減少降解。是突變提高FGF21表達量重要原因。突變蛋白穩(wěn)定性還需進一步研究。

本研究通過比較FGF21氨基酸序列和FGF家族保守序列，根據(jù)二者間差異，設計mutFGF21基因，使用生物信息學手段預測突變蛋白結構變化，提供理論依據(jù)。使用基于PCR定點突變方法，進行一步PCR得到mutFGF21表達載體并在大腸桿菌中成功表達突變蛋白。結果表明，mutFGF21蛋白大部分以可溶性形式表達，表達量與hFGF21相比提高50%，HepG2細胞糖吸收試驗表明突變蛋白具有促進糖吸收功能，且與hFGF21相比略有提高。綜上所述，對FGF21改造，即第141位G突變?yōu)镕，在不改變hFGF21細胞活性基礎上提高FGF21表達量，為FGF21后續(xù)研究及產(chǎn)業(yè)化奠定基礎。

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