李金良，張 莉，李春燕，彭意開，王 穎，呂鳳霞，陸兆新*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

西索米星(Sisomicin)是一種重要的氨基糖苷類抗生素，它的半合成化合物奈替米星(Natimicin)有高效低毒的特性，是氨基糖苷類抗生素中較理想的一個(gè)品種，應(yīng)用廣泛[1-4]。目前國內(nèi)生產(chǎn)的Sisomicin原料藥約占世界產(chǎn)量的80%以上[5]，采用的生產(chǎn)菌株主要是朱堅(jiān)屏等[6]篩選得到的橄欖星孢小單孢菌無錫亞種和福州大學(xué)陳劍鋒等[7]采用的伊尼奧小單孢菌M.inyoensis F003。該兩種生產(chǎn)菌株皆為小單孢菌，目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)小單孢菌以外的Sisomicin生產(chǎn)菌株，經(jīng)多年菌種改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化[8-9]后仍不能完全滿足市場(chǎng)的需要。近年來在Sisomicin高產(chǎn)菌株篩選、菌種改造等方面的報(bào)道有所減少[10-11]，相反生產(chǎn)工藝的研究卻日趨成熟[12-13]，產(chǎn)量進(jìn)一步提升的空間有限。因此，篩選新型、高產(chǎn)菌株有望突破限制Sisomicin生產(chǎn)能力進(jìn)一步提升的瓶頸。

本實(shí)驗(yàn)室從連云港海域潮間帶采集的樣品中篩選到1株具有高抑菌活性的鏈霉菌株——海洋鏈霉菌GB-2[14]，經(jīng)分離純化鑒定，其抑細(xì)菌活性物質(zhì)為Sisomicin[15-16]。這是首次發(fā)現(xiàn)小單孢菌以外的Sisomicin生產(chǎn)菌株，發(fā)酵液在121℃、紫外照射、pH1和pH12處理?xiàng)l件下抑菌活性基本不變[15]，具有重要的市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。

事實(shí)上，菌種選育和過程控制是提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最常用的兩種手段[17-18]，在優(yōu)勢(shì)菌株的基礎(chǔ)上通過對(duì)pH值、溫度、溶氧(DO)、培養(yǎng)基組分等條件的調(diào)控可以達(dá)到快速提高產(chǎn)量的目的。PB設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)曲面法(RSM)[19]已被證明是一種快速、有效的統(tǒng)計(jì)篩選和復(fù)雜優(yōu)化的技術(shù)手段，越來越廣泛地應(yīng)用于抗生素[20]、工業(yè)用酶[21]和化學(xué)提取[22]等方面。本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)[23]優(yōu)化海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin的發(fā)酵條件，確定主要響應(yīng)因素的最佳水平和交互作用，以期達(dá)到提高產(chǎn)量、降低成本的目的，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

海洋鏈霉菌GB-2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏[14]，原發(fā)酵條件下效價(jià)387.03U/mL。指示菌株短小芽孢桿菌(CMCC(B)63202)，購自中國科學(xué)院微生物菌種保藏中心。

供試菌株活化培養(yǎng)基：高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基[14]；種子及原始發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉培養(yǎng)基[14]；指示菌株培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[14]；PB設(shè)計(jì)與RSM發(fā)酵培養(yǎng)基：按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配制。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子液制備

用接種環(huán)挑取2環(huán)活化好的斜面菌種到含有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48h，作為種子液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將種子液以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于設(shè)定發(fā)酵條件下培養(yǎng)120h，發(fā)酵結(jié)束后放瓶備用。

1.2.3 指示菌的培養(yǎng) 將短小芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上活化，30℃培養(yǎng)14～18h，臨用前用生理鹽水清洗備用。

1.3 Sisomicin產(chǎn)量的測(cè)定

發(fā)酵液預(yù)處理：將培養(yǎng)好的發(fā)酵液置于10000r/min離心15min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

微生物效價(jià)檢定：采用杯碟法[24]，發(fā)酵優(yōu)化階段效價(jià)采用一劑量法測(cè)定，原始效價(jià)與優(yōu)化后效價(jià)采用三劑量法測(cè)定。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 PB試驗(yàn)篩選關(guān)鍵因子

從培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件兩個(gè)方面考慮關(guān)鍵因子的選擇，玉米粉、黃豆粉、葡萄糖、酵母膏是常用的放線菌發(fā)酵原料，PB設(shè)計(jì)中量的確定由多次單因素試驗(yàn)測(cè)得，發(fā)酵時(shí)間根據(jù)生產(chǎn)曲線確定，初始pH值參照發(fā)酵前后發(fā)酵液pH值變化確定，溫度、轉(zhuǎn)速、接種量為分析比較海洋鏈霉菌GB-2和小單胞菌M.inyoensis F003基本特性后確定。因此，在本實(shí)驗(yàn)中所選擇的因素主要有：玉米粉、黃豆粉、葡萄糖、酵母膏、發(fā)酵時(shí)間、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、起始pH值和發(fā)酵溫度，分別用X1～X9表示。發(fā)酵液預(yù)處理后經(jīng)適當(dāng)稀釋測(cè)定生物效價(jià)。以效價(jià)(titer)為響應(yīng)值，每一自變量的低、高試驗(yàn)水平分別以－1、1進(jìn)行編碼。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析皆采用JMP軟件(version7.0，SAS Institute Inc.)，每組設(shè)2次重復(fù)，結(jié)果取平均值。因素編碼及自變量水平見表1。

表1 PB篩選設(shè)計(jì)試驗(yàn)因子水平及編碼Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman screening design

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果與中心組合試驗(yàn)(CCD)的設(shè)計(jì)原理[25-26]，分別用X1、X2、X3、X4表示黃豆粉、葡萄糖、溫度、搖床轉(zhuǎn)速。對(duì)于其他影響不顯著的參數(shù)，皆選定在低水平。發(fā)酵液預(yù)處理后適當(dāng)稀釋進(jìn)行生物效價(jià)測(cè)定。以效價(jià)為響應(yīng)值，每一自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析皆采用Design-Expert軟件，每組設(shè)2次重復(fù)，結(jié)果取平均值。因素編碼及自變量水平見表2。

表2 中心旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Factors and levels for CCD

該模型通過最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)方程為：

式中：Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值；A0為常數(shù)項(xiàng)；Ai為線性系數(shù)；Aii為二次項(xiàng)系數(shù)；Aij為交互項(xiàng)系數(shù)；xi、xj為自變量編碼值。按照中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，設(shè)2個(gè)中心點(diǎn)，需要進(jìn)行26組試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin關(guān)鍵因子的確定

表3 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design and results

PB的試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明該篩選模型顯著(P＜0.05)，影響海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin的主要因素是：黃豆粉(P=0.0015)、葡萄糖(P=0.00016)、轉(zhuǎn)速(P=0.0038)和溫度(P=0.000026)，此4個(gè)因素都在95%水平上差異顯著。玉米粉、酵母膏、發(fā)酵時(shí)間、接種量和pH值在95%水平上差異不顯著，說明其接近最優(yōu)水平或者遠(yuǎn)離試驗(yàn)考慮范圍。因此，選擇黃豆粉、葡萄糖、溫度、轉(zhuǎn)速作為影響海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin的關(guān)鍵因素，其余因素皆選定為低水平進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.2.1 海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果和中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，做四因素三水平的響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，1～24是析因試驗(yàn)，25、26是中心試驗(yàn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。

對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，可以得到效價(jià)對(duì)編碼自變量黃豆粉、葡萄糖、轉(zhuǎn)速和溫度的二次多項(xiàng)式方程：

從表5對(duì)模型的方差分析結(jié)果看，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著(P=0.1568＞0.05)，僅有約7.5%的實(shí)驗(yàn)變異不能由該模型預(yù)測(cè)(R2Adj=0.9247)。從回歸方程各項(xiàng)的顯著性檢驗(yàn)可以看出，轉(zhuǎn)速對(duì)Sisomicin效價(jià)的曲面效應(yīng)顯著，黃豆粉、葡萄糖、溫度不顯著；葡萄糖和黃豆粉的交互作用影響顯著，其余均不顯著；葡萄糖、溫度、轉(zhuǎn)速的線性影響效應(yīng)顯著。

表4 RSM設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值的測(cè)定值Table 4 Expeirmental design and response results for RSM

表5 響應(yīng)面二次多項(xiàng)模型及其各項(xiàng)的方差分析表Table 5 ANOVA for the response surface quadratic model

2.2.2 海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin響應(yīng)面交互作用與優(yōu)化

為確認(rèn)黃豆粉質(zhì)量濃度、葡萄糖質(zhì)量濃度、溫度、搖床轉(zhuǎn)速4個(gè)因素對(duì)海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin交互作用的影響，根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖以及等高線圖。

圖 1 黃豆粉和葡萄糖質(zhì)量濃度交互作用影響Sisomicin效價(jià)的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of oybean flour and glucose concentration on sisomicin production

圖1顯示了在溫度和轉(zhuǎn)速位于中心水平時(shí)，黃豆粉和葡萄糖對(duì)海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin效價(jià)的響應(yīng)面圖及等高線圖?？梢钥闯龃藘梢蛩亟换プ饔蔑@著[27-28]。葡萄糖與黃豆粉之間的比例變化會(huì)較大影響Sisomicin的產(chǎn)量，且兩者存在一定的協(xié)同作用，這說明合適的碳氮比(C/N)海洋鏈霉菌GB-2菌體生長(zhǎng)和Sisomicin的合成需要控制合適的C/N。葡萄糖等速效碳源在低質(zhì)量濃度時(shí)能夠促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)，縮短調(diào)整期，但是在質(zhì)量濃度較高時(shí)會(huì)引起菌體過量生長(zhǎng)，其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡而縮短發(fā)酵時(shí)間，過量部分葡萄糖又會(huì)導(dǎo)致pH值下降，對(duì)抗生素發(fā)酵產(chǎn)生抑制或阻礙作用[5,29]，這在本實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。黃豆粉是大部分氨基糖苷類抗生素發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)的主氮源，在低質(zhì)量濃度時(shí)提高黃豆粉的量可以延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)。但是在本實(shí)驗(yàn)室條件下?lián)u瓶發(fā)酵時(shí)，黃豆粉質(zhì)量濃度過高則會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基會(huì)過于黏稠而影響氧氣傳遞，反而引起Sisomicin產(chǎn)量下降。

本實(shí)驗(yàn)在分析4個(gè)影響因子時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅有黃豆粉和葡萄糖交互作用顯著，其余因子之間交互作用皆不顯著，這與Adinaryanak[25]、Raza[29]等的報(bào)道不符，此兩位學(xué)者在相關(guān)優(yōu)化研究中皆發(fā)現(xiàn)了4組交互作用顯著的因子。推測(cè)其原因可能為它們都是分析因子對(duì)發(fā)酵的影響，影響機(jī)理或作用機(jī)制相似，而非像本實(shí)驗(yàn)中將培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件一并進(jìn)行分析。由此，本實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步推測(cè)海洋鏈霉菌GB-2在發(fā)酵生產(chǎn)Sisomicin時(shí)，培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件之間不存在明顯的交互作用，即兩者變化互不影響。因此，在以后誘變株以及基因工程菌株優(yōu)化時(shí)可以將培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件分別進(jìn)行優(yōu)化以縮短研究時(shí)間，降低成本。

溫度對(duì)抗生素發(fā)酵影響顯著，過高或者過低都會(huì)影響菌株生長(zhǎng)以及多種酶的活性，嚴(yán)重時(shí)甚至改變代謝途徑。朱堅(jiān)屏等[30]在對(duì)橄欖星孢小單孢菌M-41發(fā)酵生產(chǎn)西索米星進(jìn)行優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)在在33～35℃時(shí)可以達(dá)到一個(gè)較高發(fā)酵效價(jià)平臺(tái)，并建議在工業(yè)生產(chǎn)中溫度應(yīng)該控制在(34±0.5)℃。這與本研究發(fā)現(xiàn)的28℃存在較大差別。海洋鏈霉菌GB-2自海洋中篩選得到[14]，適宜在常溫(25℃)條件下發(fā)酵，溫度過高不利于發(fā)酵進(jìn)行，這是海洋鏈霉菌GB-2與小單孢菌的一個(gè)典型差別。

海洋鏈霉菌GB-2發(fā)酵生產(chǎn)Sisomicin是好氧發(fā)酵過程，成熟菌絲細(xì)成長(zhǎng)鏈狀，搖床轉(zhuǎn)速過高或過低都會(huì)對(duì)Sisomicin發(fā)酵帶來不利影響，搖床轉(zhuǎn)速過低會(huì)導(dǎo)致通氣量不足，難以滿足正常生長(zhǎng)需要，過高則會(huì)導(dǎo)致菌絲斷裂，菌的形態(tài)發(fā)生變化，改變了培養(yǎng)液的流變學(xué)特性，導(dǎo)致抗生素生物合成能力的下降。這與朱堅(jiān)屏等[30]的報(bào)道相一致。

根據(jù)多元二次模型方程和因素顯著水平，計(jì)算出效價(jià)(Y)的最大值為726.11U/mL，此時(shí)Y值所對(duì)應(yīng)的xi分別為x1=11.95，x2=2.96，x3=27.80，x4=183.43，即海洋鏈霉菌GB-2發(fā)酵產(chǎn)Sisomicin的最適搖瓶發(fā)酵條件為玉米粉20g/L、黃豆粉11.95g/L、葡萄糖2.96g/L、酵母膏2.5g/L、碳酸鈣1g/L、接種量5%、pH7.0、溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速183r/min(根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況將轉(zhuǎn)速由理論值183.43r/min調(diào)整為實(shí)際值183r/min)、發(fā)酵時(shí)間120h，此時(shí)海洋鏈霉菌GB-2液體發(fā)酵上清液中Sisomicin的產(chǎn)量為726.11U/mL。

2.2.3 回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性在最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，所得發(fā)酵上清液中Sisomicin的產(chǎn)量平均為743.66U/mL，實(shí)驗(yàn)值與理論值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)僅為2.0792%，可見采用PB和RSM試驗(yàn)可以很好地對(duì)海洋鏈霉菌GB-2發(fā)酵生產(chǎn)Sisomicin進(jìn)行優(yōu)化。

福州大學(xué)陳劍鋒等[7]采用的伊尼奧小單孢菌M.inyoensis F003發(fā)酵液中以純組分計(jì)Sisomicin質(zhì)量濃度約為0.9～1.1g/L(相當(dāng)于493.2～602.8U/mL)，優(yōu)化后的海洋鏈霉菌GB-2發(fā)酵產(chǎn)Sisomicin效價(jià)已高于目前市場(chǎng)上正在使用的小單孢菌生產(chǎn)菌株，展現(xiàn)出了良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。與工業(yè)上應(yīng)用廣泛的伊尼奧小單孢菌發(fā)酵相比，還需繼續(xù)對(duì)海洋鏈霉菌GB-2進(jìn)行育種改良[31-32]、工藝調(diào)控、無機(jī)鹽及微量元素調(diào)節(jié)和分子生物學(xué)[33-34]等方面的研究。

3 結(jié) 論

海洋鏈霉菌GB-2是除小單孢菌以外新型Sisomicin生產(chǎn)菌株。本實(shí)驗(yàn)在PB篩選設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過RSM法對(duì)關(guān)鍵因子以及它們之間的交互作用進(jìn)行優(yōu)化，得到了影響海洋鏈霉菌GB-2產(chǎn)Sisomicin的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型。通過分析得出，經(jīng)過優(yōu)化后最適搖瓶發(fā)酵條件為玉米粉20g/L、黃豆粉11.95g/L、葡萄糖2.96g/L、酵母膏2.5g/L、碳酸鈣1g/L、接種量5%、pH7.0、溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速183r/min、發(fā)酵時(shí)間120h，此時(shí)海洋鏈霉菌GB-2液體發(fā)酵上清液中Sisomicin的產(chǎn)量為726.11U/mL，與原發(fā)酵條件下效價(jià)387.03U/mL相比，產(chǎn)量提高了87.61%。

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