周建科，韓朝家，唐翠苓，付艷芳

(河北大學(xué)理化分析中心，河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

苯甲酰脲類殺蟲劑是幾丁質(zhì)合成抑制劑，通過(guò)抑制昆蟲表皮幾丁質(zhì)的合成，殺滅害蟲?，F(xiàn)已在糧食、蔬菜和水果種植上得到廣泛應(yīng)用。但此類農(nóng)藥的殘效期較長(zhǎng)，其殘留對(duì)人體健康有害。美國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家對(duì)該類農(nóng)藥均制定了相應(yīng)的最大殘留限量，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定氟苯脲在柑橘中最大殘留限量為0.5mg/kg[1]，有關(guān)肉類[2]、蔬菜[3-5]、水果[5-7]和水[8-10]中該類農(nóng)藥的殘留檢測(cè)已有報(bào)道，但果汁飲品(如白葡萄汁)中此類農(nóng)藥的檢測(cè)報(bào)道很少。

目前，苯甲酰脲類農(nóng)藥的檢測(cè)主要有固相萃取-液相色譜法[1,6]、基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]、QuEChERS-液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、液下單滴微萃取-高效液相色譜法[12]、微萃取瓶富集-液相色譜法[9]等。分散液液微萃取(dispersive liquid liquid microextraction，DLLME)技術(shù)于2006年由Assadi等[13]首次提出，具有操作簡(jiǎn)單、快速、富集能力強(qiáng)、有機(jī)溶劑用量少等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用該處理方法對(duì)白葡萄汁中4種苯甲酰脲類化合物進(jìn)行提取、濃縮，結(jié)合正相高效液相色譜法，建立白葡萄汁中氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲、氟鈴脲4種苯甲酰脲類農(nóng)藥的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白葡萄汁 市售。

氟苯脲(98.8%)、殺鈴脲(99.5%)、除蟲脲(90%)、氟鈴脲(99.3%) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、二氯甲烷、無(wú)水乙醇和正己烷(均為色譜純)，所用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-6A高壓輸液泵 日本島津公司；7125型手動(dòng)進(jìn)樣閥 美國(guó)Rheodyne 公司；LINEAR 200紫外檢測(cè)器 美國(guó)熱電公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；N2000色譜工作站 浙江大學(xué)智能信息工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 正相色譜分離條件

色譜柱：Apollo Silica柱(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：200nm；進(jìn)樣量：10.0μL；流動(dòng)相：正己烷-無(wú)水乙醇(7：3，V/V)；采用色譜峰保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰面積定量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲、氟鈴脲標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度均為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各200μL于2mL的具塞錐形刻度管中，微氮?dú)饬髭s走甲醇，用流動(dòng)相溶解并定容至2mL，制成標(biāo)準(zhǔn)混合液，4℃冰箱存放。用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合液，配制系列工作溶液。

1.3.3 樣品預(yù)處理

于10mL具塞尖底離心試管中，加入5.0mL樣品溶液(NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為3.7)。將225μL二氯甲烷和1.2mL甲醇混勻，用注射器迅速注入樣品溶液，形成乳濁液體系，靜置3min，以3500r/min離心3min，用250μL微量進(jìn)樣器吸取離心管底部二氯甲烷相于具塞錐形刻度管中，微氮?dú)饬鞔抵两桑?00μL流動(dòng)相溶解，混勻。取10μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

圖 1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of benzoylurea insecticide standards

實(shí)驗(yàn)考察190～280nm范圍內(nèi)4組分的紫外吸收情況，結(jié)果表明，在195～215nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)吸收，若采用反相色譜分離，常用的流動(dòng)相溶劑在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)往往有吸收，基線噪聲大，干擾測(cè)定。而正相色譜中正己烷等常用流動(dòng)相則不會(huì)造成此種干擾，故本實(shí)驗(yàn)選用正相色譜法。實(shí)驗(yàn)證明，在200nm波長(zhǎng)下靈敏度高且基線噪聲小，故選200nm作為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。在等度洗脫條件下，考察不同體積比正己烷-無(wú)水乙醇作為流動(dòng)相時(shí)出峰情況，當(dāng)體積比為97：3時(shí)，4個(gè)組分能完全分離。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 萃取劑和分散劑選擇

萃取劑的性質(zhì)是影響萃取效率的重要因素之一。萃取劑需滿足一定的條件：密度最好大于樣品溶液；易溶于分散劑不易溶于樣品溶液；富集效果好；不影響后續(xù)色譜分析。實(shí)驗(yàn)考察二氯甲烷、三氯甲烷和氯苯對(duì)目標(biāo)化合物的萃取情況，三氯甲烷和氯苯對(duì)組分出峰有干擾，二氯甲烷對(duì)目標(biāo)化合物沒(méi)有干擾且萃取效果較好。

萃取劑體積對(duì)萃取效率有一定影響，在分散劑(甲醇)體積一定(1.2mL)的情況下，考察二氯甲烷100～300μL時(shí)，4種苯甲酰脲類化合物的萃取情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。故選擇萃取劑體積是225μL。

圖 2 萃取劑體積對(duì)峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction solvent volume on peak area

圖 3 分散劑體積對(duì)峰面積的影響Fig.3 Effect of dispersive solvent volume on peak area

分散液液微萃取中的分散劑要能夠很好的溶解樣品和萃取劑。實(shí)驗(yàn)考察甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃作為分散劑時(shí)的情況。結(jié)果表明，乙醇和乙腈能很好的溶于樣品，但萃取效率較低；丙酮對(duì)目標(biāo)化合物出峰有干擾；四氫呋喃不能很好的分散于樣品溶液中；甲醇既有好的溶解能力，又有高的萃取效率，故選甲醇做分散劑。

分散劑的體積是影響萃取效率的又一重要因素，體積過(guò)小，分散效果不好，導(dǎo)致萃取效率不高；體積過(guò)大，目標(biāo)化合物會(huì)過(guò)多的溶解于樣品和分散劑中，同樣降低萃取效率。實(shí)驗(yàn)考察分散劑體積0.8～1.4mL時(shí)的萃取情況，結(jié)果見(jiàn)圖3，選擇甲醇的體積是1.2mL。

2.3 萃取時(shí)間

在分散液液微萃取中，萃取時(shí)間是從向樣品溶液中加入萃取劑和分散劑混合溶液到開(kāi)始離心的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)考察1～8min時(shí)的萃取情況，結(jié)果表明，萃取時(shí)間小于3min時(shí)，回收率略小于萃取時(shí)間為3min時(shí)；萃取時(shí)間大于3min時(shí)，回收率不再增加。故實(shí)驗(yàn)選定萃取時(shí)間為3min。

2.4 酸度

酸度往往對(duì)萃取效果有影響。氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲、氟鈴脲在中性或弱酸性介質(zhì)中穩(wěn)定。所測(cè)樣品白葡萄汁本身的pH值為2.7，實(shí)驗(yàn)考察pH值為2.7～5.6時(shí)，對(duì)4種待測(cè)物萃取效率的影響情況。結(jié)果表明，溶液pH值為3.7時(shí)，萃取效率最高，如圖4所示。

圖 4 pH值對(duì)峰面積的影響Fig.4 Effect of pH value on peak area

2.5 線性方程及檢出限

移取系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在所選的色譜條件下，以Y(峰面積)對(duì)X(質(zhì)量濃度)繪制工作曲線，4組分在0.33～100μg/mL范圍內(nèi)線性良好，其線性方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限見(jiàn)表1。

表1 線性方程及方法檢出限Table 1 Linear equations and detection limits for insecticides

2.6 精密度

在最佳色譜條件下，將20μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)所得到的峰面積分別計(jì)算4個(gè)組分的精密度，氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲和氟鈴脲的RSD范圍在0.59%～1.74%之間，表明此方法的精密度良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法的精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 2 Results of precision experiments (n=6)

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.3節(jié)樣品預(yù)處理方法，配制樣品加標(biāo)溶液。室溫下放置，分別于0、1、2、4、8、12h在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。計(jì)算4個(gè)組分的峰面積的RSD值在1.04%～1.78%范圍內(nèi)，表明該方法在12h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stability of the method

2.8 加標(biāo)回收率

表4 加標(biāo)回收率及RSD(n=6)Table 4 Recoveries and RSD (n = 6) of benzoylurea insecticides

圖 5 樣品加標(biāo)色譜圖Fig.5 Chromatogram of spiked sample

實(shí)驗(yàn)考察兩個(gè)加標(biāo)量條件下，氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲和氟鈴脲在白葡萄汁樣品中的加標(biāo)回收率。每個(gè)加標(biāo)樣品，均準(zhǔn)確移取6份樣品溶液，按照優(yōu)化的樣品處理方法和色譜條件，進(jìn)行4個(gè)組分的含量分析。結(jié)果見(jiàn)表4。4組分的平均回收率范圍在73.2%～97.85%之間，RSD值在1.33%～4.62%范圍之間。說(shuō)明方法重現(xiàn)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。樣品加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖5。

2.9 樣品測(cè)定

在優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)市售白葡萄汁樣品進(jìn)行測(cè)定，4組分未被檢出，樣品色譜圖見(jiàn)圖6。

圖 6 樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of real sample

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了分散液液微萃取-正相色譜法同時(shí)測(cè)定白葡萄汁中氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲和氟鈴脲的方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、有機(jī)溶劑用量少，屬于環(huán)境友好的檢測(cè)方法。市售白葡萄汁中4組分均未檢出。

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