王長(zhǎng)鋒，陶能?chē)?guó)*，黃師榮

(湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105)

果實(shí)色澤是柑橘的主要外觀品質(zhì)，隨著人們生活水平的提高，果實(shí)色澤已悄然成為消費(fèi)者判斷果品接受與否或者物有所值的重要參考[1]。類(lèi)胡蘿卜素是絕大多數(shù)柑橘品種的著色物質(zhì)，其合成受品種、成熟度、采收期、貯藏方式、貯藏條件和環(huán)境因素等的綜合影響[2-5]。醫(yī)學(xué)研究表明，柑橘果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素還具有清除人體有害自由基、增強(qiáng)人體免疫力、預(yù)防心血管疾病、防癌抗癌和預(yù)防維生素A缺乏癥等功能[6]。因此，柑橘果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素代謝已逐漸引起人們的濃厚興趣。

紅肉臍橙(Citrus sinensis Osbeck)是華盛頓臍橙的天然芽變，是迄今世界上唯一果肉因含番茄紅素和β-胡蘿卜素而著色粉紅的臍橙品種，20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)于委內(nèi)瑞拉，1990年由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘研究所從美國(guó)引種至我國(guó)，在湖北、湖南、浙江、江西和福建等我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)均有一定面積的栽培[1,7-8]。此外，紅肉臍橙果實(shí)還含大量的線性類(lèi)胡蘿卜素(如八氫番茄紅素等)，加之果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑未產(chǎn)生突變，因而成為研究柑橘果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素代謝的理想材料[9-11]。

本研究擬以紅肉臍橙為材料，探討常溫和低溫貯藏對(duì)柑橘果皮和果肉類(lèi)胡蘿卜素含量的影響，以期為通過(guò)調(diào)節(jié)貯藏溫度改善柑橘果實(shí)色澤品質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅肉臍橙(C. sinensis Osbeck)果實(shí)取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘研究所，果實(shí)于2009年12月26日采收。低溫貯藏的樣品直接放置于4℃恒溫保鮮柜，常溫處理的樣品則置于20℃培養(yǎng)箱中保存，每80個(gè)果實(shí)為1小區(qū)，3次重復(fù)。從采收當(dāng)天開(kāi)始，每隔1周收集果皮和果肉，冷凍干燥后用液氮研磨成粉末備用。

甲醇、乙腈、MTBE(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；正己烷、丙酮、無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鉀(分析純) 湖南師大化學(xué)試劑廠；番茄紅素、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；β-隱黃素、葉黃素、反式紫黃質(zhì)、八氫番茄紅素、花藥黃質(zhì)、α-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品 瑞士Carote Nature公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo 706超低溫冰箱、FS60超聲波振蕩儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；J-20XP離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；5301真空濃縮儀 德國(guó)Eppendorf公司；Direct-Q3超純水制備設(shè)備 法國(guó)Millipore公司；U-2800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；1525高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 類(lèi)胡蘿卜素提取

類(lèi)胡蘿卜素的提取參考Lee[7]方法稍有改進(jìn)。分別稱取0.5g左右果皮和果肉干樣，加15mL提取劑(正己烷：丙酮：無(wú)水酒精＝2：1：1，V/V，含0.1‰ BHT)，超聲波萃取30min后4000×g離心10min，沉淀用15mL提取劑重復(fù)提取2次至無(wú)色。合并上清液，用飽和NaCl水溶液反復(fù)洗3次至中性，吸取上層液，用正己烷定容至20mL，將上層液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于2mL甲基叔丁基醚(MTBE)(含0.1‰ BHT)，再加2mL 10% KOH-甲醇溶液避光條件下皂化10h。加4mL飽和NaCl水溶液和2mL MTBE(含0.1‰ BHT)使之更好的分層，洗走水層，再加3次5mL飽和NaCl水溶液洗至中性。將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用1mL MTBE(含0.1‰ BHT)溶解定容備用。

1.4 類(lèi)胡蘿卜素的HPLC分析

HPLC分析條件：2996PDA檢測(cè)器，YMCC30色譜柱；流動(dòng)相：A：乙腈：甲醇=3：1 (含0.0l% BHT，0.05% TEA)，B：100% MTBE(含0.01% BHT)；流速為lmL/min；上樣體積為20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為450nm。梯度洗脫：0min，A：B(95：5)；0～10min，A：B(95：5)；10～19min，A：B(86：14)；19～29min，A：B(75：25)；29～54min，A：B(50：50)；54～66min，A：B(26：74)；67min，A：B(95：5)。

Empower軟件控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理色譜結(jié)果。各組分含量以μg/g干質(zhì)量(μg/g DW)表示，總類(lèi)胡蘿卜素含量以各鑒定組分的含量之和計(jì)算。番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素、反式紫黃質(zhì)、八氫番茄紅素、花藥黃質(zhì)和α-胡蘿卜素含量根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算；α-隱黃素和順式紫黃質(zhì)的含量參照β-隱黃素和反式紫黃質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組有3次重復(fù)，采用常規(guī)的分析方法來(lái)標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，ANOVA來(lái)分析顯著性差異(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅肉臍橙果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素的組成

采用反相高效液相色譜(reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)技術(shù)，根據(jù)組分保留時(shí)間，比較標(biāo)準(zhǔn)品以及PDA檢測(cè)器檢測(cè)出的波譜特點(diǎn)，并參照前人文獻(xiàn)[7,12]，初步鑒定了紅肉臍橙果皮和果肉中類(lèi)胡蘿卜素的各種組分(表1)。紅肉臍橙果皮共鑒定組分15個(gè)，分別為反式紫黃質(zhì)、順式紫黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、葉黃素、八氫番茄紅素、玉米黃素、β-隱黃素、ζ-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素等；紅肉臍橙果肉類(lèi)胡蘿卜素共鑒定出組分16個(gè)，分別為反式紫黃質(zhì)、順式紫黃質(zhì)、花藥黃質(zhì)、葉黃素、α-隱黃素、八氫番茄紅素、玉米黃素、β-隱黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、番茄紅素順式異構(gòu)體和番茄紅素等。

表 1 紅肉臍橙果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素組分的色譜和光譜特點(diǎn)Table 1 Chromatographic and spectral characteristics of the identifed carotenoids in ‘Cara Cara’ fruit

2.2 貯藏溫度對(duì)紅肉臍橙果皮類(lèi)胡蘿卜素組分的影響

從圖1可以看出，貯藏的前5周內(nèi)，常溫有利于紅肉臍橙果皮總類(lèi)胡蘿卜素和各類(lèi)胡蘿卜素組分的積累，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，這種優(yōu)勢(shì)逐漸被低溫取代。常溫條件下，紅肉臍橙果皮總類(lèi)胡蘿卜素和各組分含量呈現(xiàn)出現(xiàn)一個(gè)逐步上升的趨勢(shì)，這種趨勢(shì)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱直至含量降低，且不同組分出現(xiàn)含量高峰的時(shí)間差別較大。其中，總類(lèi)胡蘿卜素、八氫番茄紅素、β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、花藥黃質(zhì)、反式紫黃質(zhì)、順式紫黃質(zhì)于采后3周達(dá)到高峰，含量分別為(464.70±45.37)、(212.88±25.28)、(3.73±0.57)、(2.39±0.35)、(10.48±1.91)、(59.99±3.99)和(159.42±9.66)μg/g(以干質(zhì)量計(jì)，下同)；而玉米黃素和β-隱黃素的含量高峰則出現(xiàn)在采后第1周，含量分別為(1.39±0.18)μg/g和(14.15±2.83)μg/g；葉黃素的含量甚微，勉強(qiáng)能檢測(cè)到。常溫貯藏6周后，紅肉臍橙果皮總類(lèi)胡蘿卜素和各類(lèi)胡蘿卜素含量基本保持穩(wěn)定。對(duì)低溫貯藏而言，紅肉臍橙果皮總類(lèi)胡蘿卜素和各類(lèi)胡蘿卜素組分含量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加?？傤?lèi)胡蘿卜素、八氫番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-隱黃素、反式紫黃質(zhì)和順式紫黃質(zhì)含量于采后第9周達(dá)到峰值，分別為(327.18±58.59)、(123.63±19.43)、(1.78±0.20)、(42.45±6.45)、(28.47±6.48)μg/g和(120.64±23.69)μg/g；葉黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素和花藥黃質(zhì)的峰值出現(xiàn)在采后第6周，含量分別為(1.11±0.22)、(1.91±0.13)、(1.60±0.19)μg/g和(5.10±0.54)μg/g；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，總類(lèi)胡蘿卜素和各組分含量基本保持不變。

圖 1 貯藏溫度對(duì)紅肉臍橙果皮類(lèi)胡蘿卜素含量影響Fig.1 Effect of storage temperature on carotenoid contents

2.3 貯藏溫度對(duì)紅肉臍橙果肉類(lèi)胡蘿卜素組分的影響

圖 2 貯藏溫度對(duì)紅肉臍橙果肉類(lèi)胡蘿卜素含量影響Fig.2 Effect of storage temperature on carotenoid contents

從圖2可以看出：低溫有利于紅肉臍橙果肉類(lèi)胡蘿卜素的積累。低溫貯藏條件下，紅肉臍橙果肉總類(lèi)胡蘿卜素、八氫番茄紅素、番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素和葉黃素于采后第1周達(dá)到峰值，含量分別為(278.00±21.85)、(125.03±7.23)、(185.33±14.57)、(0.40±0.04)、(11.79±2.63)、(5.11±1.03)μg/g和(3.98±0.90)μg/g，且含量顯著高于常溫貯藏(P＜0.05)，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，上述組分含量基本保持穩(wěn)定。常溫條件下，紅肉臍橙果肉β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、α-隱黃素、β-隱黃素和葉黃素含量緩慢上升，貯藏10周時(shí)達(dá)到峰值(24.56±2.56)、(0.55±0.03)、(3.71±0.05)、(3.55±0.21) 和(5.55±0.07)μg/g，隨后下降至采收時(shí)水平；番茄紅素含量于采后第3周達(dá)到峰值(105.88±14.03)μg/g，隨后逐漸下降，至第11周時(shí)顯著低于采收時(shí)含量。常溫和低溫貯藏的紅肉臍橙果肉花藥黃質(zhì)含量變化趨勢(shì)類(lèi)似，貯藏3周時(shí)達(dá)到峰值(4.49±0.63)μg/g和(5.35±0.31)μg/g，且兩者間含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)，隨后逐漸降低。常溫貯藏的紅肉臍橙果肉順式紫黃質(zhì)和反式紫黃質(zhì)出現(xiàn)兩個(gè)小高峰，分別為貯藏第1周和第10周；而低溫貯藏的紅肉臍橙果肉順式紫黃質(zhì)和反式紫黃質(zhì)兩個(gè)高峰出現(xiàn)的時(shí)間則分別為第5周和第10周。

3 討 論

溫度是柑橘果實(shí)采后貯藏條件中對(duì)果實(shí)品質(zhì)影響最大的環(huán)境因子[13]。類(lèi)胡蘿卜素對(duì)溫度極其敏感，偏離最佳著色溫度1℃都可以對(duì)果實(shí)著色產(chǎn)生顯著影響[14]。對(duì)柑橘果實(shí)色澤而言，15～25℃的溫度有利于果皮黃色類(lèi)胡蘿卜素的積累，但柑橘果肉中類(lèi)胡蘿卜素的含量基本保持穩(wěn)定[15-17]。

本研究也表明，采后紅肉臍橙果皮和果肉類(lèi)胡蘿卜素的代謝存在明顯差別。常溫(20℃)不僅促進(jìn)紅肉臍橙果皮玉米黃素和紫黃質(zhì)的積累，而且還能促進(jìn)八氫番茄紅素等線性類(lèi)胡蘿卜素的積累，從而使總類(lèi)胡蘿卜素含量增加。這一結(jié)果與前人關(guān)于常溫(20℃)通常有利于溫州蜜柑黃色類(lèi)胡蘿卜素(如β-胡蘿卜素、β-隱黃素、玉米黃素和紫黃質(zhì))的積累，促進(jìn)柑橘果實(shí)著色的報(bào)道相似[16]。奇怪的是，紅肉臍橙果皮β-隱黃素在貯藏1周時(shí)少量增加，隨后保持較穩(wěn)定的水平，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)至5周后又逐漸下降，顯著低于采收時(shí)的含量(P＜0.05)。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與品種特性有關(guān)。Van Wyk等[18]研究發(fā)現(xiàn)， 20℃能導(dǎo)致Palmer臍橙果皮著色品質(zhì)下降。常溫貯藏的紅肉臍橙果肉除β-胡蘿卜素、葉黃素，α-隱黃素含量于采后第10周急劇上升外，其余類(lèi)胡蘿卜素含量只在貯藏前1周內(nèi)小幅增加，隨后保持較為穩(wěn)定的水平。

與前人報(bào)道類(lèi)似[16]，在貯藏初期，低溫(4℃)能基本保持紅肉臍橙果皮總類(lèi)胡蘿卜素和各組分的含量，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組分呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)，特別是八氫番茄紅素和β-隱黃素的含量在采后5周后急劇增加；而低溫(4℃)貯藏誘導(dǎo)紅肉臍橙果肉八氫番茄紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和紫黃質(zhì)等的積累。根據(jù)前人報(bào)道，番茄紅素的最佳合成溫度為15～25℃，5℃的低溫能顯著抑制番茄紅素的合成[19]。因此，低溫條件下紅肉臍橙果肉番茄紅素的積累說(shuō)明形成番茄紅素的上游途徑開(kāi)始大量啟動(dòng)。在植物類(lèi)胡蘿卜代謝途徑中，八氫番茄紅素的合成是關(guān)鍵步驟之一，受八氫番茄紅素合成酶(PSY)基因的遺傳控制，該基因的表達(dá)與柑橘果實(shí)類(lèi)胡蘿卜素含量呈明顯的正相關(guān)[9-11,20]。從代謝途徑分析，紅肉臍橙八氫番茄紅素含量增加可能與低溫誘導(dǎo)PSY基因上調(diào)表達(dá)有關(guān)。這一假設(shè)與總類(lèi)胡蘿卜素含量和番茄紅素下游代謝物(如β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和紫黃質(zhì)等)的增加相吻合。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，貯藏溫度對(duì)紅肉臍橙果皮和果肉類(lèi)胡蘿卜素含量的影響存在組織特異性。常溫(20℃)對(duì)紅肉臍橙果皮著色的積極作用只維持在貯藏的前5周；低溫(4℃)能基本保持貯藏初期果皮類(lèi)胡蘿卜素含量，但含量低于常溫貯藏。除貯藏10周時(shí)β-胡蘿卜素、葉黃素、α-隱黃素含量有一個(gè)小幅增加外，常溫對(duì)紅肉臍橙果肉類(lèi)胡蘿卜素總體影響不大；低溫貯藏的紅肉臍橙果肉類(lèi)胡蘿卜素含量于采后1周達(dá)到峰值，隨后含量基本保持穩(wěn)定。

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