厲 望，靳 挺*，武玉學(xué)

(1.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027；2.浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315100)

氧化與人類及其他動(dòng)物的許多疾病諸如癌癥、老化、動(dòng)脈硬化等的發(fā)病機(jī)理有關(guān)。適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以降低體內(nèi)自由基水平，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，幫助機(jī)體抵御疾病。介于蛋白質(zhì)和氨基酸間的肽類由于結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，與其他生物分子如氨基酸、大分子蛋白質(zhì)等比較，食用安全性更高，具有極強(qiáng)的活性和多樣性，而且容易被吸收利用，同時(shí)還具有獨(dú)特的生理功能，如降血壓、抗氧化、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力等。其抗氧化性相比于蛋白質(zhì)和氨基酸往往更為顯著，通過(guò)蛋白質(zhì)的可控酶解技術(shù)制備天然的抗氧化肽將能很好地解決以上需求[1-3]。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，將有越來(lái)越多的抗氧化肽被開(kāi)發(fā)，作為功能性基料或添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)[4]。

水解魚(yú)蛋白中蛋白質(zhì)含量高，必需氨基酸比例較高，含有較高水平的微量元素碘和硒，VB2和VB5含量也較為豐富[5]，可作為制取抗氧化肽的理想原料。目前國(guó)內(nèi)外有不少研究者用不同種類的蛋白在適當(dāng)條件下經(jīng)過(guò)酶解制備抗氧化活性肽，如侯雅坤等[6]利用核桃蛋白酶解，制備了具有良好抗氧化性的酶解物；Li Lin等[7]水解鳙魚(yú)制得抗氧化肽；李俊江等[8]研究鵝肉蛋白酶解物的抗氧化特性及功能特性。本實(shí)驗(yàn)以DPPH自由基清除率為主要指標(biāo)，水解度為輔助指標(biāo)，選用4種蛋白酶對(duì)帶魚(yú)進(jìn)行酶解，篩選出最適用酶，并優(yōu)化帶魚(yú)蛋白的酶解工藝，研究酶解產(chǎn)物的抗氧化特性，旨在為帶魚(yú)蛋白制備抗氧化肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶魚(yú)，市售，去頭和內(nèi)臟，貯于－20℃冰箱中備用。

堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L，酶活力2.4AU/g)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme，酶活力500LAPU/g)、中性蛋白酶(Neutrase，酶活力0.8AU/g) 丹麥諾維信公司；木瓜蛋白酶(酶活力200萬(wàn)U/g) 南寧龐博生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1型電動(dòng)高速組織搗碎機(jī) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HHS型恒溫水浴鍋、85-2型恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)器械有限公司；722S型紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Kjeltec 2300凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；DELTA-320pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Sartorius(BP211D)電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Aminosys A200氨基酸自動(dòng)分析儀 德國(guó)安米諾西斯公司。

1.3 方法

1.3.1 帶魚(yú)蛋白酶解液的制備

帶魚(yú)肉→去頭內(nèi)臟洗凈→按比例加水→攪成肉糜→水浴鍋中酶解并不斷攪拌→90℃水浴中滅酶15min→4000r/min、4℃離心20min→過(guò)濾取上清液→酶解產(chǎn)物

1.3.2 酶種類的選擇

分別選用堿性蛋白酶(Alcalase 2.4L)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)、中性蛋白酶(Neutrase)、木瓜蛋白酶，確定帶魚(yú)、蒸餾水質(zhì)量比1:3，水解時(shí)間5h，加酶量1.6%(以魚(yú)肉質(zhì)量的百分比計(jì))，按照表1所示，在各蛋白酶最適pH值和溫度條件下進(jìn)行水解。綜合考慮酶解物DPPH自由基清除率和水解度，篩選出最適用酶。

表 1 各種酶酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of 4 kinds of proteases

1.3.3 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

分別采用中性甲醛滴定法[9]和凱氏定氮法[10]測(cè)水解液中氨基態(tài)氮含量和樣品總氮含量，按式(1)計(jì)算水解度。

1.3.4 酶解物DPPH自由基清除率的測(cè)定

稱取DPPH試劑12.80mg，用50%乙醇溶解，定容轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度為256.1mg/L DPPH 儲(chǔ)備液，置于冰箱中備用，使用前用50%乙醇稀釋至質(zhì)量濃度為25.61mg/L。將DPPH溶液室溫條件下靜置10min 后，加入樣品待測(cè)液2mL，搖勻，放置一定時(shí)間，以乙醇調(diào)零，測(cè)定波長(zhǎng)517nm處吸光度(Ai)。測(cè)定2mL DPPH溶液與2mL 50%乙醇溶液在波長(zhǎng)517nm處吸光度(Ao)，測(cè)定2mL樣品待測(cè)液與2mL 50%乙醇溶液在波長(zhǎng)517nm處吸光度(Aj)[11]。每個(gè)樣品重復(fù)3次，求得清除率平均值。

1.3.5 酶解物還原力的測(cè)定

在1mL各濃度樣品中，加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液和2.5mL 0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6)，混勻后在50℃水浴保溫20min，然后加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸，混合后以3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3，室溫反應(yīng)10min后在波長(zhǎng)700nm處測(cè)其吸光度[12]，吸光度越大則樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.3.6 酶解物·OH清除率的測(cè)定

取5mmol/L的鄰二氮菲溶液1mL于試管中，依次加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)2mL和蒸餾水1mL、5mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，充分混勻，加0.1%的H2O21mL，于37℃條件下恒溫反應(yīng)60min，于波長(zhǎng)536nm處測(cè)其吸光度AP；同前步，以1mL蒸餾水代替其中的H2O2，測(cè)得的吸光度Ab；用樣品液1mL代替其中的1mL蒸餾水，測(cè)得吸光度As[13]。

1.3.7 響應(yīng)面分析因素及水平表

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解溫度(X1)、酶解時(shí)間(X2)、加酶量(X3)為變量，展開(kāi)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，分析因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表 2 響應(yīng)面分析因素及水平Table 2 Analytical factors and levels for response surface methodology

1.3.8 帶魚(yú)蛋白酶解物分子質(zhì)量的測(cè)定

采用Sephadex G-25凝膠，選用柱管內(nèi)徑15mm，柱長(zhǎng)50cm的層析柱。采取標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)照層析方法測(cè)定酶解物的分子質(zhì)量。上樣量1mL，以1/15mol/L pH6.98磷酸鹽緩沖液(含0.15mol/L NaCl洗脫，流速0.5mL/min。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別為BSA、胰凝乳蛋白酶原A、溶菌酶、VB12，分子質(zhì)量分別為67000、25000、14400、1355D，各取10mg用上述磷酸鹽緩沖液定容于10mL容量瓶中。測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)樣出峰時(shí)間(t)，以出峰時(shí)間為橫坐標(biāo)(x)，標(biāo)準(zhǔn)樣分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值(lgM)為縱坐標(biāo)(y)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶解物的分子質(zhì)量(M)由其出峰時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

1.3.9 帶魚(yú)蛋白酶解物氨基酸組成分析

按GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸測(cè)定》和GB/T 15399—1994 《飼料中含硫氨基酸測(cè)定：離子交換色譜法》，在氨基酸自動(dòng)分析儀上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇

酶的專一性決定了某種蛋白酶只作用于某些肽鍵或帶有某種基團(tuán)的氨基酸所形成的肽鍵。酶種類不同，其底物特異性和作用位點(diǎn)也不同，這決定了酶解產(chǎn)物的組成、結(jié)構(gòu)和功能，因此需要篩選出能高效作用于低值魚(yú)蛋白的蛋白酶。

圖 1 不同蛋白酶解物的DPPH自由基清除率和水解度Fig.1 DPPH radical scavenging rate and hydrolysis degree of the enzymatic hydrolysates obtained by different proteases

由圖1可知，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率較高，風(fēng)味蛋白酶的水解度最大。各種蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和水解度分別為堿性蛋白酶(46.15%，14.13%)，木瓜蛋白酶(43.38%，14.20%)、風(fēng)味蛋白酶(35.64%，15.23%)、中性蛋白酶(37.91%，13.37%)。風(fēng)味蛋白酶是經(jīng)米曲霉發(fā)酵制得真菌蛋白酶和肽酶的復(fù)合體，包含內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性，主要從肽鏈內(nèi)部或肽鏈末端切斷肽鍵，將多肽水解為低分子小肽和氨基酸，因而水解程度較高。堿性蛋白酶是一種內(nèi)切絲氨酸蛋白酶，主要用于切斷蛋白質(zhì)肽鏈內(nèi)部的肽鍵，生成多肽等中間產(chǎn)物，且可以裂解谷氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸和賴氨酸等羧端肽鍵[14]，其酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率較高。因此綜合考慮抗氧化活性與水解效果，選用堿性蛋白酶作為水解用酶。

2.2 帶魚(yú)蛋白酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響

在酶解溫度50℃、加酶量1.6%、固液比1:3，調(diào)節(jié)酶解時(shí)間3、4、5、5.5、6h，考察酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響。由圖2可知，水解度隨著水解時(shí)間的增加，呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在6h時(shí)達(dá)到16.3%。酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，在4h時(shí)達(dá)到最大值46.15%，之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)開(kāi)始減小。在反應(yīng)的開(kāi)始階段，酶活力高，酶切位點(diǎn)多，反應(yīng)速率快，水解度顯著增大；隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶的活性部位被飽和，反應(yīng)速率降低，水解趨于平緩，多肽逐漸水解為無(wú)抗氧化作用的氨基酸，而多肽為清除自由基的主要成分[15]，因而DPPH自由基清除率下降。因此酶解時(shí)間以4h左右為宜。

圖 2 酶解時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis duration on DPPH radical scavenging rate and hydrolysis degree of resultant hydrolysates

2.2.2 酶解溫度對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響

在固液比1:3、酶解時(shí)間3h、加酶量1.6%，調(diào)節(jié)酶解溫度30、40、45、50、55、60℃，考察酶解溫度對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，DPPH自由基清除率與水解度逐漸增大，在50℃時(shí)達(dá)到最大值，分別為46.15%和14.2%，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，清除率與水解度開(kāi)始減小。在反應(yīng)的初始階段，溫度較低，酶活性較低，隨著溫度的升高，體系的內(nèi)能逐漸增大，酶與底物之間的接觸機(jī)會(huì)增多，酶促反應(yīng)速率加快，水解度上升，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，當(dāng)其所處環(huán)境的溫度高于某一點(diǎn)時(shí)，酶蛋白的特定結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，酶的活性也會(huì)降低甚至失活，此時(shí)水解度開(kāi)始下降，因此酶催化反應(yīng)要有一個(gè)適宜的溫度[16]。酶解溫度以50℃左右為宜。

圖 3 酶解溫度對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging rate and hydrolysis degree of resultant hydrolysates

2.2.3 加酶量對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響

在酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3h、固液比1:3，調(diào)節(jié)加酶量0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，考察加酶量對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著加酶量增大，相應(yīng)DPPH自由基清除率顯著增大，在加酶量為1.6%時(shí)達(dá)最大值55.37%，而后逐漸減小。水解度隨著加酶量的增加顯著增大，在加酶量大于1.2%時(shí)，變化趨于平穩(wěn)。加酶量增加雖然可以提高蛋白質(zhì)水解速率，但同時(shí)也增加了水解液中的抗氧化肽段被降解成無(wú)抗氧化作用的小肽段及游離氨基酸的幾率[17]。綜合考慮酶的使用成本，加酶量以1.6%為宜。

圖 4 加酶量對(duì)DPPH自由基清除率、水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme addition amount on DPPH free radical scavenging rate and hydrolysis degree of resultant hydrolysates

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果，選擇酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量3個(gè)因素，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，見(jiàn)表3。堿性蛋白酶酶解帶魚(yú)蛋白的工藝優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了15組試驗(yàn)，其中1～12組為析因點(diǎn)和零點(diǎn)試驗(yàn)，13～15組為中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。利用Design-Expert8.0.7軟件對(duì)DPPH自由基清除率與各水解因素進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y=59.647－1.99X1+0.705X2－4.07X3－2.68X1X2+0.895X1X3+3.225X2X3－8.143X12－4.253X22－7.303X32，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表 3 Box-Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Beknhen tests

表 4 DPPH自由基清除率為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)式模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model describing DPPH radical scavenging rate

由表4可知，回歸方程R2=0.9757，RAdj2=0.9627，說(shuō)明該模型方程有很好的精密度，回歸效果較好，可信度高；失擬項(xiàng)不顯著(P=0.6507＞0.05)，表明該模型擬合程度良好，因此以該模型優(yōu)化帶魚(yú)蛋白的酶解工藝是合適的，能很好地預(yù)測(cè)酶解各因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響。

試驗(yàn)中一次項(xiàng)X1(酶解溫度)、X3(加酶量)及交互項(xiàng)X2X3(酶解時(shí)間和加酶量)，X1X2(酶解溫度和酶解時(shí)間)和全部二次項(xiàng)影響較為顯著，各個(gè)因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由F值可知，酶解溫度和加酶量對(duì)結(jié)果影響較大，酶解時(shí)間影響較小。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)應(yīng)自變量酶解溫度、酶解時(shí)間、酶用量所構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖，可直觀地反映出各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響。利用二次多項(xiàng)式回歸方程和Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.7軟件作圖分析(圖5)，可以看出清除率存在最高點(diǎn)。對(duì)上述回歸方程求解，可得X1=0.1272，X2=－0.0654，X3=－0.2853，Y有最大值，即蛋白酶解物清除DPPH自由基的最佳條件組合為：酶解溫度48.57℃、酶解時(shí)間3.81h、加酶量1.65%、固液比1：3，此時(shí)DPPH自由基清除率為59.81%。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在酶解溫度48℃、酶解時(shí)間3.8h、加酶量1.65%、固液比1：3的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的DPPH自由基清除率為60.13%，實(shí)測(cè)值和最佳理論值誤差在±1%以內(nèi)，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)帶魚(yú)蛋白酶解物清除DPPH自由基的情況。

圖 5 各因素交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Response surface plots for the effects of the cross-interactions among different variables on DPPH radical scavenging rate

2.3 酶解物的還原力和對(duì)·OH的清除率

在2.2節(jié)所得優(yōu)化條件下酶解帶魚(yú)蛋白，測(cè)定酶解物的還原力和對(duì)·OH的清除率。由圖6可知，酶解起始階段，酶解物還原力和對(duì)·OH的清除率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在酶解3.8h時(shí)達(dá)到最大；但隨著酶解的繼續(xù)開(kāi)始減小。這與前述結(jié)論多肽逐漸水解成無(wú)抗氧化作用的氨基酸導(dǎo)致抗氧化能力下降是相符的?？梢?jiàn)所得酶解物具有良好的還原力和對(duì)·OH清除能力，表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

圖 6 酶解物還原力和清除·OH的能力Fig.6 Reducing power and hydroxyl radical scavenging rate of resultant hydrolysates

2.4 帶魚(yú)蛋白酶解物的分子質(zhì)量

圖 7 帶魚(yú)蛋白酶解物層析譜圖Fig.7 Sephadex G-25 chromatographic pattern of optimal hairtail protein hydrolysates

經(jīng)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.7 4 7 0－0.0 3 1 3 t (R2=0.9829)。由圖7可知，酶解物的出峰時(shí)間為84min，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得樣品帶魚(yú)蛋白酶解液的分子質(zhì)量為1311D。范建鳳等[18]研究了蟹抗氧化肽的分離純化，蟹抗氧化肽經(jīng)Sephadex G-25凝膠分離得到3種組分，其中分子質(zhì)量為1096.5D的組分抗氧化活性較強(qiáng)；據(jù)文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道，分子質(zhì)量低于3000D的多肽不僅容易吸收，加工性能好，易與其他調(diào)料協(xié)調(diào)搭配，而且還顯示出良好的如降血脂、抗氧化等生理活性。本研究帶魚(yú)蛋白酶解物分子質(zhì)量在3000D以下，層析圖中只出現(xiàn)1個(gè)洗脫峰，分子質(zhì)量較為接近，可見(jiàn)帶魚(yú)蛋白具有開(kāi)發(fā)制備抗氧化產(chǎn)品的潛力。

2.5 帶魚(yú)蛋白酶解物氨基酸組成分析

將經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析收集的洗脫峰樣品進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果如表5所示。酶解產(chǎn)物含有蘇氨酸、亮氨酸、賴氨酸和蛋氨酸等人體必需氨基酸，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的37.13%；據(jù)文獻(xiàn)[21]報(bào)道，丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甘氨酸和纈氨酸對(duì)清除自由基有較好的效果，經(jīng)計(jì)算上述氨基酸含量占總氨基酸含量的35.1%；帶魚(yú)蛋白酶解物構(gòu)成肽的氨基酸含量占總氨基酸含量的89.8%，含量較為豐富，因此低分子肽為帶魚(yú)蛋白酶解物的主要成分。

表 5 酶解物氨基酸組成分析Table 5 Amino acids compositions of the hydrolysates

3 結(jié) 論

以DPPH自由基清除率為主要指標(biāo)，水解度為輔助指標(biāo)，分別選用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，在各自最適pH值和溫度條件下對(duì)帶魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，其中堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率較高。因此綜合考慮抗氧化能力和水解效果，選用堿性蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到，堿性蛋白酶水解帶魚(yú)蛋白所得酶解液清除DPPH自由基的最佳條件為酶解溫度48℃、加酶量1.65%、酶解時(shí)間3.8h、固液比1:3，清除率達(dá)到60.13%；所得酶解物具有良好的還原力和對(duì)·OH的清除能力，分子質(zhì)量為1311D；酶解物含有清除自由基作用較好的氨基酸，構(gòu)成肽的氨基酸含量占總氨基酸含量的89.8%，低分子肽為帶魚(yú)蛋白酶解物的主要成分。由此看來(lái)，帶魚(yú)蛋白酶解物對(duì)DPPH自由基和·OH有很好的清除作用，且有較好的還原力，表現(xiàn)出一定的抗氧化能力，為帶魚(yú)蛋白制取天然抗氧化肽提供了理論依據(jù)。

[1] LYENGAR R, MCEVILY A J. Antibrowning agents： alternatives to the use of sulfi tes in foods[J]. Trends Food Sci Technol, 1992, 3： 60-64.

[2] 丁利君, 黃小梅, 何穎基. 羅非魚(yú)蛋白制取多肽酶解條件的優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2008, 24(2)： 15-19.

[3] CHAN K M, DECKER E A, MEANS W J. Extraction and activity of Carnosine, a naturally occurring antioxidant in beef muscle[J]. J Food Sci, 1993, 58(1)： 1-4.

[4] 張昊, 任發(fā)政. 天然抗氧化肽的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(4)： 443-447.

[5] 王新星, 孔凡華, 許團(tuán)輝, 等. 水解魚(yú)蛋白營(yíng)養(yǎng)組成及評(píng)價(jià)[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2011, 32(3)： 104-110.

[6] 侯雅坤, 王晟, 黃昆, 等. 核桃蛋白酶解工藝優(yōu)化與酶解液抗氧化活性分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(4)： 99-103.

[7] LI Lin, WANG Jinshui, ZHAO Mouming, et al. Artificial neural network for production of antioxidant peptides derived from big head carp muscles with alcalase[J]. Food Technology and Biotechnology, 2006, 44(3)： 441-448.

[8] 李俊江, 潘道東, 郭宇星, 等. 鵝肉蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(3)： 126-130.

[9] 朱儉. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1987： 100-159.

[10] 張意靜. 食品分析技術(shù)[M]. 北京： 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2001： 186-194.

[11] BOUGATEF A, NEDJAR A N, MANNI L, et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle(Sardinella aurita)by-product proteins[J]. Food Chemistry, 2010, 118(3)： 559-565.

[12] OYAIZU M. Studies on products of browning reaction： antioxdative activities of products of browning reaction prepared from glucosamne[J]. Japanese Journal of Nutrition, 1986, 44： 307-315.

[13] 陳學(xué)勤. 抗氧化研究實(shí)驗(yàn)方法[M]. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 1996： 499-500.

[14] ADAMSON N J, REYNOLDS E C. Characterization of casein phosphor peptides prepared using Alcalase： determination of enzyme specificity[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1996, 19(3)： 202-207.

[15] 陳軒, 周堅(jiān), 李吉緒, 等. 分布酶解制備鰱魚(yú)抗氧化肽的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(15)： 181-186.

[16] 毛善勇, 周瑞寶, 儀凱, 等. Protamex水解牛肉的研究[J]. 鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 25(2)： 61-63.

[17] 宋茹, 馮婷立, 謝超. 海產(chǎn)小雜魚(yú)抗氧化肽制備工藝[J]. 食品科學(xué), 2012, 32(12)： 29-32.

[18] 范建鳳, 王則南, 楊柯, 等. 蟹抗氧化肽的分離純化及活性研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(13)： 48-51.

[19] JE J Y, PARK P J, KIM S K. Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska pollack (Theragra chalcogramma) frame protein hydrolysate[J]. Food Research International, 2005, 38(1)： 45-50.

[20] FAHMI A, MORIMURA S, GUO H C, et al. Production of angiotensin Ⅰ converting enzyme inhibitory peptides from sea bream scales[J]. Process Biochemistry, 2004, 39(10)： 1195-1200.

[21] GIMENEZ B, ALEMON A, MONTERO P, et al. Antioxidant and functional properties of gelatin hydrolysates obtained from skin of sole and squid[J]. Food Chemistry, 2009, 114： 976-983.