單樹花，武海麗，李宗偉，袁琳潔，趙文彬，劉慶午，郭茂林，李卓玉,*

(1.山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；2.太原師范學院生物系，山西 太原 030031)

腫瘤是危害人類健康的嚴重疾病之一。雖然腫瘤的治療取得了很大的進展，但抗癌化學藥物在治療癌癥的同時，對人體本身也會產(chǎn)生很大的毒副作用。很多病人在治療后復發(fā)或轉移，或因反復用藥產(chǎn)生耐藥性。因此，尋找療效高、毒性低的天然抗癌成分，一直是國內外醫(yī)學界研究的熱點。大量研究表明，許多天然產(chǎn)物中含有低毒、高效的抗腫瘤活性成分，如黃酮、生物堿類、揮發(fā)油類、萜類、苷類等一些小分子物質[1]。近年來隨著分子生物學、分子腫瘤學、現(xiàn)代提取分離和分析測試技術的發(fā)展，一些抗腫瘤的活性多肽，如：大米米糠和苦瓜中的多肽[2-5]和一些植物蛋白(如：遼東楤木[6]、毛蚶[7]、桑黃菌[8])已經(jīng)從天然產(chǎn)物中篩選出來，這對抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)具有重要的意義。

谷子，即小米或粟(Setaria italica)，英文名(foxtail millet)，一年生禾本科屬植物，起源于我國黃河流域。小米米糠是小米經(jīng)壟谷脫殼，碾米等加工成精米過程中得到的副產(chǎn)品。小米米糠中含有豐富的甘油三酯、脂蛋白、谷維醇、VB、VE、葡萄糖、纖維素以及微量元素等，能夠排出人體內的毒素，有健腦、補腎、強身、抗癌等作用，經(jīng)常食用小米米糠，可以增強人體的免疫功能，防病健身[9]。目前由于小米米糠的口感不佳，主要被用作飼料，或被作為廢棄物處理，所以小米米糠資源的深度開發(fā)和有效利用將會帶來很高的經(jīng)濟和社會價值。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道，目前國內外關于小米米糠的研究主要集中在其化學成分和營養(yǎng)價值方面[10]，而未見關于小米米糠抗腫瘤活性蛋白的報道。本研究中， 以純天然小米米糠為原料，制備并純化小米米糠中的有效活性蛋白，并對其抗腫瘤細胞活性進行研究，從而為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)，同時也促進小米米糠的深度開發(fā)和這一資源的有效增值利用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

小米米糠(Setaria italica)由山西省天下谷股份有限公司提供。

人結腸癌細胞系DLD1、人宮頸癌細胞株HeLa、和人正常肝細胞株HL-7702，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Thermo Scientific Hyclone公司；無支原體胎牛血清 武漢博士德生物工程有限公司；噻唑藍(MTT) 北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO) 美國Amresco公司；胰蛋白酶 北方同正公司；青鏈霉素(100X) 碧云天生物技術研究所；Protein Marker 生工生物工程(上海)股分有限公司；苯甲酰-DL-Arg-P-硝基酰替苯胺鹽酸鹽(BAPA) 上海三杰生物技術有限公司；培養(yǎng)細胞熒光染色凋亡顯示試劑盒 北京威格拉斯生物技術有限公司；Q柱和SP柱介質材料 美國GE公司；其他化學試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

5417離心機 德國Eppendorf公司；756MC型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Milli-QA10超純水儀、超濾管 美國Millipore公司；微量Gilson加樣器 法國Gilson公司；凝膠電泳儀、Microplate Reader Model 550酶聯(lián)免疫檢測儀 美國Bio-Rad公司；inoLad Multi 720酸度計 德國WTW公司；CO2細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；細胞培養(yǎng)板 美國Hyclone公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 小米米糠粗蛋白的制備及純化

取30g干燥的谷糠，粉碎，按1:5(m/V)的量加入蛋白提取液(20mmol/L Tris-HCl，含0.85% NaCl，1mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)，pH8.0)，4℃條件下放置過夜，11000r/min離心30min，取上清，加入2倍體積的－20℃預冷的丙酮，于－20℃沉淀1h，11000r/min離心30min，棄上清，沉淀在－20℃條件下放置20min，使丙酮完全揮發(fā)。將沉淀用pH8.0、20mmol/L的Tris-HCl緩沖液溶解，11000r/min離心30min，取上清即為小米米糠粗蛋白。向上清液中先加入30%飽和度的硫酸銨粉末溶解后，靜置30min，11000r/min離心，收集上清液，再向上清液中加入85%飽和度的硫酸銨粉末溶解后，靜置30min，11000r/min離心，收集沉淀，用Tris-HCl緩沖液溶解、透析、濃縮即得到小米米糠中抗腫瘤粗蛋白。

將小米米糠抗腫瘤粗蛋白進行Q-陰離子交換層析，收集穿透液；再將穿透液進行SP-陽離子柱交換層析，先用40mmol/L的Tris-NaCl緩沖液(pH8.0，20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中含有40mmol/L的NaCl)洗脫，去雜蛋白；再用100mmol/L的Tris-NaCl緩沖液(pH8.0，20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中含有100mmol/L的NaCl)洗脫，紫外檢測儀于280nm波長檢測，收集洗脫峰，將此洗脫液在80℃水浴中孵育15min熱變性法進一步去雜蛋白，即得到具有抗腫瘤的小米米糠活性純蛋白。

1.2.2 蛋白質量濃度的測定

采用考馬斯亮藍染色法對樣品的蛋白質量濃度進行測定。以1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)配成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的蛋白質量濃度梯度，在595nm波長處測定溶液的吸光度，以A595nm為橫坐標，標準蛋白含量為縱坐標，繪制標準曲線。取樣品20μL進行測定。

1.2.3 蛋白質表觀分子質量的測定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定蛋白質的表觀分子質量，12%分離膠，進行恒壓電泳，濃縮膠的電壓為60～80V，分離膠的電壓為80～120V。

1.2.4 細胞培養(yǎng)

人結腸癌細胞系DLD1、人宮頸癌細胞株HeLa和人正常肝細胞株HL-7702均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(含100U/mL青鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 細胞增殖實驗

采用MTT法。選取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化后，用血球計數(shù)板計數(shù)。調整細胞濃度為每孔8000個細胞/100μL培養(yǎng)液，加到96孔培養(yǎng)板中。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待細胞貼壁后取出培養(yǎng)板，加入不同質量濃度的小米米糠純蛋白20μL，使其終質量濃度分別為0.025、0.05、0.075、0.1μg/μL，每個濃度設5個平行孔。培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，取出培養(yǎng)板，每孔加入20μL 5.0mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去板中培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO，振蕩均勻，于波長570nm處測定各孔光吸光度。

1.2.6 細胞形態(tài)學實驗

常規(guī)方法培養(yǎng)、傳代各細胞，采用血球計數(shù)板進行計數(shù)，調整細胞濃度為8×104個/孔(每孔1mL)，接種到30mm×30mm的小皿中，待細胞貼壁后，吸掉舊培養(yǎng)基，加入1mL新鮮培養(yǎng)基和200μL的 0.1μg/μL小米米糠蛋白，處理48h，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并掃描細胞核的形態(tài)(×60)，照相。

1.2.7 數(shù)據(jù)整理

2 結果與分析

2.1 小米米糠中抗腫瘤活性蛋白的分離純化

表 1 FMB蛋白的分離純化Table 1 Purification of FMB protein

圖 1 SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白的分離純化Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified target protein

上圖各個泳道顯示了小米米糠蛋白的純化過程。首先采用丙酮沉淀法提取該小米米糠粗蛋白(泳道1)，隨后用30%～85%飽和度的硫酸銨沉淀活性蛋白組分(泳道2)，再將該組分過Q-陰離子交換層析柱，發(fā)現(xiàn)活性蛋白成分在穿透液里(泳道3)。將上述穿透液上樣于SP-陽離子交換層析柱，先用pH8.0、40mmol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗柱，洗掉雜蛋白，再用pH8.0 100mmol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液洗柱，收集此洗脫峰，即為具抗腫瘤活性的蛋白(泳道4)，最后將該蛋白在80℃的水浴中孵育15min熱變性法進一步去雜蛋白，得到電泳純的活性蛋白(泳道5)，其表觀分子質量約為35kD左右，將該蛋白命名為FMB。

2.2 小米米糠中抗腫瘤活性蛋白組分對細胞增殖活力的影響

圖 2 谷糠活性粗蛋白對DLD1、HL-7702細胞增殖的影響Fig.2 Effects of the crude protein extract and its fractions at different saturation degrees of ammonium sulfate on the growth of DLD1 and HL-7702 cells

圖 3 圖2中蛋白組分2對DLD1細胞增殖的影響Fig.3 Effects of active components chromatographically separated from fraction 2 (as shown in Fig.2) on the growth of DLD1 cells

圖 4 Q-柱得到的活性蛋白組分2-1對DLD1細胞增殖的影響Fig.4 Effect of active components chromatographically separated from fraction 2-1 on the growth of DLD1 cells

圖 5 蛋白組分2-1-3分別用不同溫度孵育后對DLD1細胞增殖的影響Fig.5 Effect of incubation temperature on the growth inhibitory activity of active component 2-1-3 against DLD1 cells

本實驗采用MTT法，通過體外抗腫瘤活性實驗檢測小米米糠蛋白中的有效成分，用小米米糠分離過程中的各級蛋白作用于人結腸癌細胞株DLD1和人正常肝細胞株48h。MTT結果(圖2)顯示，30%～85%飽和度的硫酸銨分級沉淀所得到的谷糠蛋白對DLD1細胞有明顯抑制作用，所以該級蛋白中可能含有抗腫瘤活性組分；實驗數(shù)據(jù)還表明，各級蛋白對正常細胞HL-7702均無明顯抑制作用。圖3結果進一步表明，小米米糠蛋白活性成分在Q-陰離子柱分離時的穿透液里。將此穿透液過SP柱，100mmol/L的Tris-NaCl洗脫液被檢測到具較顯著的抗腫瘤活性(圖4)。SDS-PAGE結果表明，該組分主要為一條35kD的蛋白條帶(圖1)。為了進一步純化該蛋白，將該蛋白分別在37、60、80、100℃的水浴中孵育15min，發(fā)現(xiàn)該蛋白仍具有細胞活性(圖5)，且通過此步驟得到進一步的純化，SDS-PAGE結果顯示為單一條帶，見圖1的泳道5。

2.3 不同質量濃度的小米米糠活性蛋白對各種腫瘤細胞增殖活力的影響

圖 6 不同質量濃度的小米米糠活性蛋白對細胞株HL-7702、DLD1、HeLa細胞增殖的影響Fig.6 Effect of FMB concentration treatment on the growth of HL-7702, DLD1 and HeLa cells

為了比較FMB對不同腫瘤細胞增殖能力的影響，采用不同質量濃度(0.025、0.050、0.075、0.100μg/μL)的FMB分別作用于人結腸癌細胞株DLD1、人宮頸癌細胞株HeLa、人正常肝細胞HL-7702。由圖6可知，F(xiàn)MB對不同腫瘤細胞的抑制能力各不相同，其中對DLD1細胞株的抑制作用最顯著，HeLa細胞株次之；且隨著蛋白質質量濃度的增加，抑制率也逐漸增強，具有明顯的劑量依賴性；而對正常細胞株HL-7702無明顯抑制作用。如圖6結果所示，當FMB的終質量濃度為0.1μg/μL時，體外處理上述各細胞株48h后，DLD1細胞生長抑制率為44%，HeLa細胞生長抑制率為37%，HL-7702細胞抑制率為7.7%。在表2中顯示了經(jīng)FMB處理后，獲得的各種細胞的IC50值，DLD1細胞的IC50值最小，HL-7702細胞株的IC50值最大。

表 2 FMB對腫瘤細胞(DLD1、HeLa)和正常細胞(HL-7702)毒性的影響Table 2 Cytotoxic activity of FMB against various human cancer cell lines (DLD1 and HeLa) and a normal cell line (HL-7702)

2.4 小米米糠抗腫瘤活性蛋白對不同細胞株形態(tài)特征的影響

圖 7 倒置顯微鏡下觀察FMB處理后HL-7702、DLD1和HeLa細胞的形態(tài)特征(×60)Fig.7 Morphological observation of HL-7702, DLD1 and HeLa cells after FMB treatment under an inverted microscope (×60)

倒置光學顯微鏡下觀察各細胞的形態(tài)特征(圖7)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)FMB蛋白處理48h后的DLD1和HeLa細胞的數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)細胞核明顯皺縮，變圓，部分細胞漂浮等凋亡現(xiàn)象；而對照組細胞形態(tài)正常，HeLa細胞呈多角形，胞漿豐富，核明顯可見核仁。DLD1細胞樹突狀明顯，細胞均一，生長良好。而正常細胞株HL-7702在處理前后細胞形態(tài)均無明顯變化。

3 討 論

小米米糠作為農(nóng)副產(chǎn)品，其營養(yǎng)價值豐富，來源充足、價格低廉，但目前由于人們對其價值缺乏足夠的認識，造成了大量的小米麩皮資源的浪費，若能將其充分利用，將具有很高的經(jīng)濟效益和社會價值。本研究以純天然小米米糠為原料，通過丙酮和硫酸銨沉淀法制備了米糠粗蛋白，并通過離子交換層析法和蛋白的熱穩(wěn)定性純化出了單一FMB。體外抗腫瘤活性實驗表明：該蛋白能夠顯著抑制人結腸癌細胞株DLD1和宮頸癌細胞株HeLa的增殖，并能誘導其凋亡；而對人正常肝細胞株HL-7702無明顯作用。因此，F(xiàn)MB有望成為綠色、高效的天然抗癌藥物。

3.1 小米米糠中活性蛋白的制備及純化

表1的數(shù)據(jù)表明，30g的谷糠原材料經(jīng)過一系列的制備、純化過程后能獲得3.1mg的谷糠活性純蛋白，得率較低。因此，在以后的蛋白純化中，將不斷優(yōu)化純化程序，以期大幅度的提高其得率，為以后的深入研究和開發(fā)應用奠定基礎。在純化小米米糠活性蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MB在pH8.0的緩沖溶液體系中能與SP-陽離子交換層析柱結合，由此初步推測該蛋白可能為堿性蛋白。當用100mmol/L的Tris-NaCl洗脫液洗脫與蛋白結合的層析柱時，該蛋白被洗脫下來，因而推測該蛋白的等電點大約在8.5左右。另外，蛋白熱穩(wěn)定性實驗表明，F(xiàn)MB在80℃的水浴中孵育15min后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)該蛋白不但未發(fā)生降解，而且其純度進一步提高；將FMB分別在37、60、80、100℃的水浴中孵育15min后，進行體外抗癌細胞增殖活性實驗檢測，結果發(fā)現(xiàn)該蛋白仍具有較強的抗癌細胞增殖的活性。這說明，本研究純化獲得的FMB的分子結構非常穩(wěn)定，具有較強的耐熱性，這有利于我們進一步研究其生物活性及作用機制，同時也有利于進行大規(guī)模的分離純化。

3.2 小米米糠活性蛋白對細胞增殖的影響

細胞增殖與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及退化有密切的關系。大多數(shù)抗腫瘤藥物都能抑制敏感腫瘤細胞的增殖，并且其抗腫瘤效果與腫瘤細胞在藥物誘導下發(fā)生細胞增殖抑制的活性有關[11]。本實驗采用MTT法，探討了小米米糠活性蛋白對腫瘤細胞株DLD1、HeLa及正常細胞株HL-7702增殖的影響，同時比較了各種細胞抑制率的IC50。IC50值可以用來衡量藥物誘導凋亡的能力，該數(shù)值越低，表明細胞對藥物處理越敏感。本研究中FMB對人結腸癌細胞DLD1的抑制作用最強，IC50值最小，HeLa次之。這說明，F(xiàn)MB對不同腫瘤細胞的抑制作用存在一定差異，它對人結腸癌細胞DLD1的生長抑制作用顯著，有望為結腸癌的治療提供新的靶向藥物。特別是FMB對HL-7702細胞生長基本無抑制作用，表明FMB具有特異的抑制癌細胞增殖的作用，它對正常細胞無明顯抑制作用。

3.3 小米米糠活性蛋白對細胞凋亡的影響

人類惡性腫瘤形成的重要病理學基礎是腫瘤細胞異常增殖、凋亡嚴重減退造成的。就細胞內調控調節(jié)機制而言，既須拮抗、抑制腫瘤細胞增殖，或誘導促使腫瘤細胞凋亡[12]。許多人類惡性腫瘤是由于細胞的死亡過程嚴重受阻，使得腫瘤細胞在數(shù)量上無限制惡性增生。越來越多的證據(jù)表明，化療藥物對腫瘤的作用主要是誘導腫瘤細胞死亡[13-15]，本研究也證實了這一點。細胞形態(tài)實驗結果表明FMB蛋白能促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡，尤其對DLD1細胞作用顯著。在倒置顯微鏡下可以觀察到，經(jīng)FMB處理48h后的DLD1細胞的細胞核出現(xiàn)明顯皺縮、變圓、部分細胞漂浮等典型的凋亡信號；而對正常肝細胞株HL-7702卻無明顯影響。以上實驗結果充分表明，F(xiàn)MB能顯著誘導癌細胞凋亡，但對正常細胞沒有明顯影響。

本實驗的研究結果表明來源于小米米糠中的活性蛋白不但具有較強的抗癌細胞增殖的能力，而且還能顯著誘導癌細胞發(fā)生凋亡，但對人正常細胞卻無明顯作用。該蛋白是通過何種細胞通路實現(xiàn)這一功能其作用靶點及具體分子機制又如何，這些問題都有待進行進一步的深入探討，以期為癌癥的低毒、高效治療提供新的靶向藥物。

[1] 許旭東, 胡曉茹, 楊峻山. 抗腫瘤藥用植物有效成分研究概況[J]. 中國中藥雜志, 2008, 33(17): 2073-2081.

[2] KANNAN A, HETTIARACHCHY N S, LAY J O, et al. Human cancer cell proliferation inhibition by a pentapeptide isolated and characterized from rice bran[J]. Peptide, 2010, 31(9): 1629-1634.

[3] KANNAN A, HETTIARACHCHY N S, JOHNSON M, et al. Human colon and liver cancer cell proliferation inhibition by peptide hydrolysates derived from heat stabilized defatted rice bran[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56(24): 11643-11647.

[4] PARKASH A, NG T B, TSO W W. Purification and characterization of charantin, anapin-like ribosome-inactivating peptide from bitter gourd (Momordica charantia) seeds[J]. J Pept Res, 2002, 59(5): 197-202.

[5] FANG E F, ZHANG C Z Y, ZHANG Lin, et al. RNase MC2: a new Momordica charantia ribonuclease that induces apoptosis in breast cancer cells associated with activation of MAPKs and induction of caspase pathways[J]. Apoptosis, 2011, 17(4): 377-387.

[6] MAKOTO T, MAYUMI O K, NORIO S. Aralin, a new cytotoxic protein from Aralia elata, inducing apoptosis in human cancer cells[J]. Cancer Lett, 2003, 199(1): 19-25.

[7] SONG Liyan, REN Shengfang, YU Rongmin, et al. Purification, characterization and in vitro anti-tumor activity of proteins from Arca subcrenata Lischke[J]. Mar Drugs, 2008, 6(3): 418-430.

[8] LI Ge, KIM D H, KIM D, et al. Protein-bound polysaccharide from Phellinus linteus induces G2/M phase arrest and apoptosis in SW480 human colon cancer cells[J]. Cancer Lett, 2004, 216(2): 175-181.

[9] 謝鐘琪. 谷糠治病不妨一試[J]. 現(xiàn)代養(yǎng)生, 2005(8): 18.

[10] 恩和, 龐之洪, 熊本海. 粟谷糠類飼料成分及營養(yǎng)價值比較分析[J]. 中國飼料, 2008(2): 39-41.

[11] MELET A, SONG Keli, BUCUR O, et al. Apoptotic pathways in tumor progression and therapy[J]. Adv Exp Med Biol, 2008, 6(15) : 47-79.

[12] FANG E F, ZHANG C Z Y, NG T B, et al. Momordica charantia Lectin, a Type II ribosome inactivating protein, exhibits anti-tumor activity toward human nasopharyngeal carcinoma cells in vitro and in vivo[J]. Cancer Prev Res, 2011, 5(1): 109-121.

[13] PIOTR J, BRANDON W, JORGE G, et al. A novel quinoline, MT477: suppresses cell signaling through Ras molecular pathway, inhibits PKC activity, and demonstrates in vivo anti-tumor activity against human carcinoma cell lines[J]. Invest New Drugs, 2008, 26: 223-232.

[14] SEOANE S, MONTERO J C, OCANA A, et al. Effect of multikinase inhibitors on caspase-independent cell death and DNA damage in HER2-overexpressing breast cancer cells[J]. J Natl Cancer Inst, 2010, 102(18): 1432-1446.

[15] FANG E F, ZHANG C Z Y, WONG J H, et al. The MAP30 protein from bitter gourd (Momordica charantia) seeds promotes apoptosis in liver cancer cells in vitro and in vivo[J]. Cancer Lett, 2012, 324(1): 66-74.