吳敬君，李 曄,2，張 翀，李 梅，邢新會,*

(1.清華大學化學工程系 工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，生物化工研究所，北京 100084；2.北京電子科技職業(yè)學院生物技術系，北京 100029)

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)是一類線性、硫酸化的酸性多糖，由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸)和半乳糖胺通過1→3糖苷鍵連接而成的重復二糖單元組成，其平均分子質量為25000D左右[1]。硫酸軟骨素主要包含三類：硫酸軟骨素A(chondroitin sulfate A)、硫酸軟骨素C(chondroitin sulfate C)和硫酸皮膚素(dermatan sulfate)，其廣泛存在于多種動物組織中，在軟骨和結締組織中含量尤為豐富[2]。硫酸軟骨素在降血脂、抗動脈粥樣硬化、保護眼角膜等方面具有重要作用，除此之外，硫酸軟骨素還作為添加劑廣泛用于高檔保健品、食品、飲料、滋補品和高檔化妝品中[3]。硫酸軟骨素在以上應用中存在分子質量波動大、生物利用度低、口服效果差和療效不穩(wěn)定等缺點，很多研究表明，通過化學法或者酶法制備得到的低分子質量硫酸軟骨素(平均分子質量在2000～10000D)可以有效克服以上缺點。根據(jù)酶法在環(huán)境友好性、分子質量可控性和選擇性等方面的優(yōu)勢，開發(fā)酶法制備低分子質量硫酸軟骨素方法具有重要意義[4-5]。

硫酸軟骨素酶(Chondroitinase)是能將硫酸軟骨素、軟骨素和透明質酸等糖胺聚糖裂解為不飽和二糖或者寡糖的多糖裂解酶，其通過β-消除機理裂解半乳糖胺β(1→4)糖醛酸糖苷鍵，并在糖醛酸的4,5位形成雙鍵[6]。來源于肝素黃桿菌的硫酸軟骨素酶(Chondroitinase AC，ChonAC)可以裂解硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C、軟骨素及透明質酸，分子質量為77kD[7]。最初從肝素黃桿菌發(fā)酵提純獲得，但是存在肝素黃桿菌生長緩慢、需要底物誘導、ChonAC表達水平低以及分離純化復雜等問題[7]，這些問題直接增加了酶的生產成本，難以實現(xiàn)工業(yè)化應用，因而開發(fā)ChonAC的高效重組表達技術具有極其重要的研究價值。

目前對ChonAC的異源重組表達的研究報道很少，只有Tkalec[7]和Pojasek[8]等在E. coli中表達了cslA基因，并分離純化得到活性蛋白ChonAC。Tkalec等[7]采用了pIBX1載體，但是其表達量很低，不足1000IU/L，而Pojasek等[8]在其研究中所用的載體為pET15b和pCRT7/NT，這兩個載體中的融合標簽均為His-tag，但其研究中關于His-tag的純化效果和蛋白可溶性比例等內容均未給出詳細的報道。His-tag標簽可優(yōu)點為純化蛋白操作簡單、條件溫和，但是它也存在明顯的缺點，如跟親和載體的親和力不強，采用含Ni2+螯合柱純化會對環(huán)境造成污染和不能增加與之結合蛋白的表達可溶性等。而麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，MBP)是大腸桿菌中依賴ATP轉運積累麥芽糖系統(tǒng)中重要組成蛋白質，研究發(fā)現(xiàn)其與蛋白的融合可以顯著提高蛋白重組表達的可溶性[9-10]，而且MBP能夠與麥芽糖和直鏈淀粉特異性親和吸附方便進行分離純化[11-12]。本研究小組利用融合蛋白技術將MBP分別融合到肝素酶I氮端[13]和肝素酶III的氮端并通過低溫誘導顯著的提高了肝素酶I和III的可溶性表達，并實現(xiàn)了工業(yè)化應用。同時，MBP及其配基麥芽糖和淀粉具有高安全性，有利于其融合酶在食品及醫(yī)藥催化領域的應用。考慮到ChonAC與肝素酶I的來源、酶對底物作用機理存在一定的相似性以及ChonAC的結構特點[14-15]，判斷在ChonAC的N末端進行MBP融合不會影響該酶的活性位點。因此，為了實現(xiàn)ChonAC在大腸桿菌中的高效可溶表達，本研究擬通過在ChonAC的N端進行MBP融合，構建MBP-ChonAC融合蛋白的表達載體(pMCAC-c2x)和大腸桿菌表達體系，并通過直鏈淀粉(amylose)樹脂實現(xiàn)MBP-ChonAC的一步親和純化，并對其酶學特性進行探討，旨在為ChonAC的高效生產技術及其應用研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與試劑

大腸桿菌(E. coli DH5α、E.coli TOP10、E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)(plysS)、E.coli JM109) 北京全式金生物技術有限公司；大腸桿菌(E.coli TB1)、肝素黃桿菌(Pedobacter heparinus) 本實驗室保存。

質粒pMDTM19-T Simple 寶生物工程(大連)有限公司；質粒pMAL-c2x 美國New England Biolabs公司；pMD-19-cslA、pMCAC-c2x 本實驗構建。

TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司；TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix 北京全氏金生物技術有限公司；T4 DNA連接酶 寶生物工程(大連)有限公司；底物硫酸軟骨素A(平均分子質量25000D) 南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基與儀器

對肝素黃桿菌的培養(yǎng)采用B1培養(yǎng)基，大腸桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基。B1培養(yǎng)基：3g/L CaCl、牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L，如果需要配制平板時在以上的基礎上再加15g/L瓊脂粉。LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L、胰蛋白胨10g/L，如果需要制備平板時在以上的基礎上再加15g/L瓊脂粉，篩選時可以往其中加入相應濃度的抗生素溶液；本培養(yǎng)基用于菌種短期保藏、活化培養(yǎng)及基因工程操作。M9培養(yǎng)基[16]：基礎組成為Na2HPO4·12H2O 17.1g/L、KH2PO43.0g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1.0g/L、MgSO41mmol/L，本培養(yǎng)基添加適當碳源、氮源和Ca2+用于培養(yǎng)優(yōu)化。

JN-3000PLUS低溫超高壓細胞破碎機 廣州聚能生物科技有限公司；MBPTrap HP(1mL)親和柱 美國GE Healthcare公司；GOLDS54紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.3 ChonAC基因cslA的克隆

將肝素黃桿菌接入B 1 培養(yǎng)基中，3 0 ℃培養(yǎng)4 8 h，菌體經1 0 0 0 0 r/m i n 離心1 m i n 收集后，利用TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒提取基因組，并采用pfu DNA聚合酶對cslA進行PCR擴增。以Pedobacter heparinus的基因組為模板，根據(jù)已知的cslA序列(GenBank：U27583.1)設計PCR引物。上游引物P1F： 5’-TCAGCAGACCGGTACTGCAGAAC-3’；下游引物P1R：5’-TTACTATTTCAGTTCAACCGTTGC-3’。PCR條件篩選則采用2×TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix，PCR反應體系中加入Pedobacter heparinus基因組模板50ng、兩種引物各100pmol、2×TransTaq(HiFi)PCR SuperMix 12.5μL，最后用無菌水補足至總體積25μL。反應條件為：94℃預變性5min，30次擴增(94℃、60s，54℃、60s，72℃、180s)，72℃延伸10min。反應結束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收PCR擴增的cslA基因序列，將其與AT克隆載體pMDTM-19T Simple連接，得到的重組質粒pMD-19-cslA，測序驗證后備用。

1.4 MBP-ChonAC融合蛋白表達質粒pMCAC-c2x的構建

采用Omaga質粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit II提取pMD-19-cslA質粒，以pMD-19-cslA為模板，根據(jù)GenBank報道的序列設計PCR引物，上游引物P2F：5’-TATGAGCTCTCAGCAGACCG GTACTGCAGAAC-3’ (帶下劃線的堿基為Sac I的酶切位點)，下游引物P2R：5’-CGCGAATTCTTACTATTTCAGTTCAACCGTTGC-3’ (帶下劃線的堿基為EcoR I的酶切位點)，通過PCR獲得cslA基因。經雙酶切后，用T4 DNA連接酶將cslA序列定向插入到pMAL-c2x的多克隆位點，得到質粒pMCAC-c2x。

1.5 轉化子的驗證

1.5.1 菌落PCR驗證

將1.4節(jié)構建的質粒pMCAC-c2x轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂于含100μg/L氨芐青霉素的LB抗性培養(yǎng)平板，37℃培養(yǎng)12h。用引物P2F、P2R進行菌落PCR鑒定，PCR反應體系及反應條件與1.3節(jié)相同。對擴增產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以驗證含轉化子的陽性克隆。

1.5.2 酶切驗證

對重組質粒pMCAC-c2x進行SacⅠ和EcoRⅠ雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。雙酶切反應體系組成：質粒5μL、10×Buffer 3μL、1%BSA 0.2μL、SacⅠ0.5μL、EcoRⅠ 0.5μL、滅菌水10.8μL，總體積20μL。酶切條件為：37℃酶切2～3h。酶切結束后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.3 測序驗證

將酶切鑒定后初步正確的轉化克隆交由英濰捷基(上海)貿易有限公司，進行DNA測序驗證。

1.6 重組酶的表達

種子培養(yǎng)：用接種環(huán)從平板上挑取一環(huán)菌體接種到預先滅菌的裝有5mL LB培養(yǎng)基的小管中，170r/min、37℃過夜培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)及誘導方法：在500mL的三角搖瓶中裝100mL含氨芐青霉素終質量濃度100μg/mL(氨芐青霉素待培養(yǎng)基121℃、15min滅菌冷卻至室溫后加入)的LB培養(yǎng)基，按1%體積接種量接入過夜培養(yǎng)的種子液，170r/min、37℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(OD600nm值為0.6左右)。加入一定量的誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其最終濃度為0.5mmol/L，并轉入200r/min，15℃誘導培養(yǎng)20h。

1.7 重組酶的純化

MBP-ChonAC的純化根據(jù)Chen等[16]的操作進行，簡述如下，培養(yǎng)菌體用反應緩沖液重懸(重懸后菌濃為4g/L左右，以菌體濕質量計)，往細胞重懸液中加入終質量濃度為0.2～0.4mg/mL的溶菌酶，混勻后冰浴30min；用低溫超高壓細胞破碎機將細胞重懸液進行破碎，破碎液離心后收集上清，并用0.22μm濾膜過濾后置于冰上備用；根據(jù)說明書對上述破碎液進行融合蛋白用MBPTrap HP(1mL)親和柱進行親和分離純化。

1.8 酶活及酶比活力測定

由于MBP-ChonAC裂解底物硫酸軟骨素A之后產生4,5不飽和糖醛酸產物，此產物在232nm波長處具有強烈的吸收，故采用波長232nm光吸收法測定MBP-ChonAC酶活力[17]，具體測定方法如Ye等[18]報道的方法。

1.9 重組酶的酶學特性

1.9.1 最適pH值

反應緩沖液(50mmol/L Tris，充分溶解后用1mol/L的鹽酸調節(jié)pH值至合適梯度，4℃保存)；底物溶液(50mmol/L Tris、1g/L硫酸軟骨素A，充分攪拌后用1mol/L的鹽酸調節(jié)pH值至合適的梯度，4℃保存)。將融合蛋白在以上每個對應的pH值測量酶活，研究最適反應pH值。

1.9.2 最適Ca2+濃度

在最適pH值條件下，調整反應緩沖液和底物溶液于合適梯度的Ca2+濃度，然后在對應的Ca2+濃度下測定酶活力，研究Ca2+濃度對酶活力的影響。

1.9.3 最適NaCl濃度

在最適的pH值和最適的Ca2+濃度條件下，調整反應緩沖液和底物溶液于合適梯度的NaCl濃度，然后在對應的NaCl濃度下測定酶活力，研究溶液離子強度對酶活力的影響。

1.9.4 最適酶催化溫度

將上述全部最適條件的緩沖液和底物溶液置于合適的梯度溫度中分別測定酶活力，研究溫度對酶活力的影響。

1.9.5 重組酶的熱穩(wěn)定性

考察MBP-ChonAC在30℃和35℃條件下的熱穩(wěn)定性：將酶液以及酶的反應緩沖液和底物溶液分別放到30℃和35℃條件下保溫，若干時間后取出樣品測量殘存酶活，研究重組酶的熱穩(wěn)定性。

1.10 重組酶的動力學常數(shù)

以硫酸軟骨素A為底物，配制質量濃度分別為1、0.75、0.5、0.3、0.2、0.1、0.075、0.05、0.025、0.0125g/L。所用的緩沖液各組分的濃度為1.9節(jié)實驗所得的最優(yōu)濃度，充分溶解后用1mol/L的鹽酸調節(jié)至最佳pH值后在4℃保存。測定反應速率時采用紫外-可見分光光度計，測定35℃條件下吸光度隨時間的變化曲線。掃描波長定為232nm，時間為2min。摩爾消光系數(shù)ε=3800L/(mol·cm)，具體操作步驟根據(jù)見文獻[19]。

1.11 重組酶表達量優(yōu)化

宿主優(yōu)化：從E.coli DH5α陽性克隆中提取pMCAC-c2x質粒，分別轉化E.coli TOP10、E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)(plysS)、E.coli JM109和E.coli TB1。按照1.6節(jié)所述方法進行發(fā)酵培養(yǎng)，最后收集菌體，破碎細胞進行酶活測定。

IPTG誘導濃度優(yōu)化：選擇最佳的表達宿主，加入不同體積IPTG得到一系列終濃度的IPTG進行誘導表達，考察誘導劑IPTG對MBP-ChonAC表達的影響。

培養(yǎng)基優(yōu)化：在M9培養(yǎng)基的基礎上加入酵母提取物、葡萄糖和Ca2+，設計酵母粉、葡萄糖和Ca2+三因素三水平正交試驗進行優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 PCR驗證

將cslA進行AT克隆后，挑選抗性菌株模版，用引物P2F、P2R進行菌落PCR鑒定，結果如圖1所示。cslA條帶與DNA Marker相比目標條帶大小一致，故初步判定所挑選的1、2號克隆為陽性轉化子。

圖 1 pMD-19-cslA轉化子PCR驗證電泳圖Fig.1 PCR amplifi cation of cslA ORF

2.2 酶切驗證

提取2.1節(jié)挑選的克隆提取質粒pMCAC-c2x，通過SacⅠ和EcoRⅠ雙酶切后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示，與DNA Marker對比，得到符合大小的條帶，進一步驗證了挑選的兩個克隆為陽性克隆。

圖 2 pMCAC-c2x轉化子雙酶切驗證電泳圖Fig.2 Identifi cation of pMAC-c2x expression plasmid by restriction enzyme digestion

2.3 DNA測序

將挑選的上述克隆提交給測序公司進行DNA測序。測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫使用BLAST程序進行序列比對和分析，并使用軟件DNAMAN對cslA的測序結果進行分析。通過序列對比分析發(fā)現(xiàn)，本研究得到的cslA有1個堿基發(fā)生了變化，并導致了一個氨基酸發(fā)生了變化，由文獻[7]報道的天冬酰胺Asn(N)變?yōu)樘於彼酇SP(D)。本研究的兩次獨立的擴增的測序結果完全一致。產生與文獻報道不一致的可能原因為本實驗室購買自日本東京大學菌庫(IAM)的肝素黃桿菌與文獻報道[7]的菌種系列不同。因此本研究中涉及的cslA氨基酸序列如上所述，與已有的文獻報道稍有區(qū)別，但根據(jù)已有報道，該位點不是ChonAC的底物結合位點和催化位點[14-15]，因此推斷不會對ChonAC的酶活造成影響。

2.4 重組酶的表達及純化

表 1 MBP-ChonAC純化結果Table 1 Purification of MBP-ChonAC

將經過上述驗證的陽性克隆接種培養(yǎng)發(fā)酵及破碎純化，純化結果如表1所示。經過MBPTrap HP柱一步純化可以使純化倍數(shù)達到11.2。其酶比活力可達到94.1IU/mg融合蛋白(即143.8IU/mg ChonAC蛋白當量)，比IBEX公司(http：//www.ibex.ca/ENZChonAC.htm)的200IU/mg要略小，主要原因是可能本研究僅用了一步純化，得到的融合蛋白純度和IBEX公司報道的酶活力的純化條件不同所致。

實驗結果表明，MBPTrap HP柱能夠有效的吸附MBP-ChonAC融合蛋白，通過一步親和分離純化(圖3a)，目標蛋白的純度即可達95%以上(BandScan 5.0)，如圖3b所示箭頭所指處為目標蛋白MBP-ChonAC(117.8kD)。

圖 3 融合蛋白MBP-ChonAC通過MBPTrap HP親和純化洗脫圖譜及其SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 Affi nity purifi cation of recomibinant MBP-ChonAC byMBPTrap HP and SDS-PAGE analysis of the purifi ed protein (113 kD)

2.5 重組酶的酶學特性

本研究考察了MBP-ChonAC催化反應的最適pH值、Ca2+最佳濃度、NaCl最佳濃度及最適反應溫度，如圖4所示。

圖 4 MBP-ChonAC的酶學性質Fig.4 Characteristics of MBP-ChonAC

酶催化需要其適宜的pH值環(huán)境，由圖4a可知，MBP-ChonAC的裂解硫酸軟骨素A的最適pH值范圍為7.5～8.0，與Gu等[17]報道的最適pH值范圍為4.5～6.0有較大差別，這種變化可能跟融合蛋白MBP或著MBP與ChonAC之間的連接肽可能有關，值得進一步分析。

Ca2+對于許多催化含有糖醛酸的多糖的多糖裂解酶具有幫助酶識別與結合催化底物以及穩(wěn)定催化過渡態(tài)的作用[6]。對來源于Pedobacter heparinus的ChonAC晶體結構解析發(fā)現(xiàn)，ChonAC可能含有Ca2+結合位點[15]，因此有必要研究Ca2+對ChonAC催化能力的影響。由圖4b可知，在催化體系中加入Ca2+對MBP-ChonAC的催化能力有一定的提升，當Ca2+濃度為20mmol/L時可達最佳催化效果。

酶催化體系合適的離子強度有利于維持酶的催化構象，保證催化的順利進行[19]。比較常用的鹽為NaCl，因此研究NaCl對MBP-ChonAC催化能力的影響具有重要意義。由圖4c可知，當NaCl濃度為50mmol/L時，MBPChonAC對硫酸軟骨素A的催化裂解達到最大速度，之后隨著NaCl濃度的增加其催化能力顯著下降，表明MBPChonAC催化反應需要控制離子強度。

酶催化反應的溫度會對酶催化的速率產生影響，選擇合適的催化溫度對于酶催化反應至關重要。由圖4d可知，在一定的溫度范圍內(20～65℃)，催化反應速率隨著溫度的增加顯著增加，但是到70℃以后由于酶的熱穩(wěn)定性原因，導致催化速率顯著下降，所以最佳酶催化溫度需要結合其熱穩(wěn)定性確定。

2.6 重組酶的熱穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性對于MBP-ChonAC的催化反應溫度的選擇具有重要意義，如前所述，雖然溫度的升高會加快反應，但是同時也會使蛋白失活，所以需要研究MBPChonAC在一定溫度條件下的熱穩(wěn)定性。

圖 5 MBP-ChonAC在30℃和35℃條件下的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermol stability of MBP-ChonAC at 30 ℃ and 35 ℃

由圖5可知，溫度對其熱穩(wěn)定性的影響非常明顯，MBP-ChonAC在30℃和35℃條件下都較為穩(wěn)定，其半衰期分別為8.3h和2.2h，可以滿足一般工業(yè)應用。結合2.5節(jié)的實驗結果，MBP-ChonAC適合的催化反應溫度范圍為20～35℃。

2.7 重組酶的動力學常數(shù)

表 2 ChonAC的動力學常數(shù)比較Table 2 Comparison of kinetic constants of ChonAC

由表2可知，MBP-ChonAC在35℃的動力學常數(shù)，相對于天然ChonAC，MBP-ChonAC的Km稍有升高[8]，說明MBP的融合使其與底物的親和作用有一定程度降低，而且催化常數(shù)kcat稍有降低[8]，最后導致催化效率有一定降低。但MBP-ChonAC降解硫酸軟骨素的譜圖(結果未給出)表明，MBP的融合沒有對ChonAC的催化能力產生任何影響。

2.8 重組酶表達的宿主優(yōu)化及IPTG誘導濃度優(yōu)化

選擇合適宿主可以有效提高目標蛋白的表達量，由圖6a可知，MBP-ChonAC在E.coli BL21中具有最高的總酶活力，而且菌體容易生長，pMCAC-c2x的存在對E.coli BL21產生的生長負擔最小。誘導劑濃度可以影響目標基因的轉錄水平及mRNA翻譯效率，同時也會影響菌體的生長。誘導劑濃度過低會使目標基因的轉錄速率低，過高則會使翻譯過程中蛋白的正確折疊率降低，同時還會導致細胞生長速率降低[20]。由圖6b可知，在低IPTG濃度 (0.025mmol/L) 條件下MBP-ChonAC可以高效的表達，其總酶活力及菌體酶比活力都高，但是隨著IPTG濃度的增加MBP-ChonAC的總酶活及單位菌體酶比活力都同步顯著降低，說明MBP-ChonAC表達效率降低而其菌體的生長沒有受到顯著的影響。

圖 6 MBP-ChonAC表達宿主優(yōu)化及IPTG誘導濃度優(yōu)化Fig.6 Optimization of host cells and IPTG concentration for MBPChonAC expression

2.9 重組酶表達的培養(yǎng)基優(yōu)化

本實驗室前期對MBP-肝素酶I的表達條件優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn)，在M9培養(yǎng)基基礎上加入一定量的氮源酵母粉和碳源葡萄糖可以增加菌體的代謝活性，提高MBP融合蛋白的表達量。然而加入葡萄糖過量時容易導致葡萄糖效應，其中間代謝產物會抑制lac mRNA的合成從而降低目標蛋白的表達。酵母提取物添加過多，在提高目標蛋白表達的同時也會增強某些細菌蛋白酶的合成，而葡萄糖的加入可能會恰好抑制這部分蛋白酶的表達，由此可見，葡萄糖和酵母提取物對目標蛋白的表達可能會存在一個最佳值[16,19]。除此之外，由于ChonAC晶體結構顯示，Ca2+會幫助ChonAC對底物的識別與結合以及促進酶催化反應[6,15]，本研究2.5節(jié)的結果也顯示Ca2+對催化有促進作用。另外，Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入合適濃度的Ca2+會提高目標蛋白在表達、分離和純化過程中的穩(wěn)定性。因此，本研究設計了酵母提取物、葡萄糖和Ca2+的三因素三水平正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基，以尋找MBPChonAC高活性表達的培養(yǎng)基。

表 3 基于M9培養(yǎng)基的三因素三水平的正交優(yōu)化結果及分析(n=3)Table 3 Effect of main factors of M9-based medium on enzymatic activity examined by orthogonal array design (n=3)

表 4 基于M9培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結果方差分析表Table 4 Analysis of variance for M9-based medium on enzymatic activity

由表3、4的極差和方差分析表明，各因素對總酶活的影響程度為C＞B＞A，即Ca2+濃度對總酶活力的影響最大，葡萄糖質量濃度影響次之，酵母提取物質量濃度的影響最小。按照正交試驗理論，每種因素均值最大對應的水平組合就是總酶活力最高的組合，這里對應的組合就是A1B2C3，即酵母提取物質量濃度為10g/L、葡萄糖質量濃度為4g/L、Ca2+濃度為0.5mmol/L。進一步對正交結果進行驗證和對Ca2+濃度的進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，通過正交理論分析的最佳組合得到的總酶活力(9097.8IU/L)并不是最高的，同時發(fā)現(xiàn)隨著Ca2+濃度的增加MBP-ChonAC的總酶活先增加后減小，當Ca2+濃度為1mmol/L時，MBP-ChonAC的總酶活力達到最高，為10800.5IU/L，是LB培養(yǎng)基中表達總酶活力(2223.7IU/L)的4.86倍，此結果超過目前報道最高酶活8820IU/L[8]。因此確定表達MBP-ChonAC的最優(yōu)培養(yǎng)基為M9培養(yǎng)基中加入10g/L酵母提取物、4g/L葡萄糖和1mmol/L Ca2+。

3 結 論

本研究從肝素黃桿菌中克隆cslA，進行了pMCAC-c2x質粒構建、MBP-ChonAC的異源表達、分離純化、酶學特性和熱穩(wěn)定性以及動力學常數(shù)的測定，并對pMCACc2x載體的表達進行了宿主優(yōu)化、誘導劑濃度優(yōu)化及培養(yǎng)基優(yōu)化。

3.1 通過PCR手段，從肝素黃桿菌中有效擴增得到cslA基因，通過基因重組技術構建大腸桿菌表達載體pMCAC-c2x；通過菌落PCR和酶切驗證得到確認并轉化E. coli DH5α。通過基因測序發(fā)現(xiàn)本研究中所用到的cslA基因序列與文獻報道不一致，在核苷酸序列上存在1個堿基突變，在氨基酸序列上存在1個氨基酸不同，但該位點不是ChonAC的底物結合位點和催化位點。

3.2 通過該融合蛋白表達體系實現(xiàn)了MBP-ChonAC在大腸桿菌中正確表達，并通過MBPTrap HP親和柱一步純化純度達到95%，酶比活力可達94.1IU/mg融合蛋白(即143.8IU/mg ChonAC蛋白當量)。

3.3 對MBP-ChonAC的酶學性質考察發(fā)現(xiàn)其最佳作用pH值為7.5～8.0，最佳Ca2+濃度為20mmol/L，最適NaCl濃度為50mmol/L，最佳作用溫度為20～35℃，比肝素黃桿菌的野生ChonAC的20～37℃差別不大。對MBPChonAC的熱穩(wěn)定研究發(fā)現(xiàn)， 其在30℃和35℃具有較好的熱穩(wěn)定性，其半衰期分別為8.3h和2.2h，可以用于工業(yè)應用。

3.4 對MBP-ChonAC的動力學常數(shù)進行了測定，其Km有一定增大而且催化常數(shù)kcat稍有降低，導致催化效率有一定降低，但MBP的融合沒有對ChonAC的催化能力產生影響。

3.5 為了提高MBP-ChonAC的表達量，進行了宿主優(yōu)化、誘導濃度優(yōu)化及培養(yǎng)基優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)E.coli BL21是最優(yōu)的表達宿主，最佳IPTG誘導濃度為0.025mmol/L，最佳的培養(yǎng)基為M9培養(yǎng)基中加入10g/L酵母提取物、4g/L葡萄糖和1mmol/L Ca2+，在最優(yōu)條件下，其酶活力可達到10800.5IU/L，是LB培養(yǎng)基中表達酶活力的4.86倍，超過目前報道的最高水平。

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